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Justia が 取得 ヒトから分離されたコロナウイルスに関するウイルスタンパク質 の米国特許を特許 (特許番号 7,220,852)
人から分離されたコロナウイルス
2004 年 4 月 12 日 - アメリカ合衆国疾病管理予防センター保健福祉省長官が代表
本明細書では、重症急性呼吸器症候群（SARS）の原因物質である、新たに単離されたヒトコロナウイルス（SARS-CoV）を開示する。 SARS-CoVゲノムの核酸配列およびSARS-CoVオープンリーディングフレームのアミノ酸配列、ならびにこれらの分子を使用してSARS-CoVを検出し、その感染を検出する方法も提供される。 免疫刺激組成物もその使用方法とともに提供される。
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説明
優先権の主張
本出願は、２００３年４月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／４６５，９２７号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
政府支援の声明
この発明は、米国政府の機関である疾病管理予防センターによって作成されました。 したがって、米国政府は本発明に関して一定の権利を有します。
開示分野
本発明は、新たに単離されたヒトコロナウイルスに関する。 より具体的には、本発明は、単離コロナウイルスゲノム、単離コロナウイルスタンパク質、およびそれをコードする単離核酸分子に関する。 本開示はさらに、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルスを検出する方法、および免疫原性コロナウイルス化合物を含む組成物に関する。
背景
コロナウイルス（ニドウイルス目、コロナウイルス科、コロナウイルス属）は、ヒトやその他の動物に呼吸器疾患や腸疾患を引き起こす、エンベロープに覆われた大型のプラス鎖 RNA ウイルスの多様なグループです。 そのゲノムは約 30,000 ヌクレオチド (nt) で、RNA ウイルスの中で最も大きいものです。 コロナウイルスは直径 100 ～ 160 nm の球形で、周囲を取り囲む 20 ～ 40 nm の複雑な棍棒形の表面突起があります。 コロナウイルスは、スパイクタンパク質（S）、膜タンパク質（M）、エンベロープタンパク質（E）、そしてコロナウイルスのサブセットでは血球凝集素エステラーゼタンパク質（HE）などの共通の構造タンパク質を共有しています。 S タンパク質はウイルス膜から突き出た糖タンパク質であり、宿主細胞の受容体結合に関与しており、中和抗体の標的となります。 E タンパク質と M タンパク質は、ビリオンの形成と宿主細胞からの放出に関与します。 コロナウイルス粒子は、粗面小胞体の槽内と、ビリオンが集合する感染した宿主細胞の小胞内に存在します。 コロナウイルスのゲノムは、RNAポリメラーゼを生成する2つのオープンリーディングフレーム（ORF1aおよびORF1b）と、S、E、M、およびヌクレオカプシド（N）タンパク質を含む構造タンパク質および非構造タンパク質をコードする入れ子になったサブゲノムmRNAのセットで構成されています。 コロナウイルス属には少なくとも 13 種が含まれており、血清学的および遺伝的特性に基づいて少なくとも 3 つのグループ (グループ I、II、および III) に細分されています (deVries et al., セム。 ヴィロル。 8:33–47、1997。 フィールズら。 編 フィールズウイルス学、 第 3 版、Raven Press、フィラデルフィア、1323 ～ 1341 年、1996 年。 マーヘイとコリアー編。 微生物学と微生物感染症 、第 1 巻、ウイルス学、9 番目 版、オックスフォード大学出版局、463–479、1998）。
コロナウイルスの既知の 3 つのグループは、胃腸炎や上気道疾患、下気道疾患など、人間や家畜 (牛、豚、猫、犬、げっ歯類、鳥など) のさまざまな病気に関連しています。 既知のコロナウイルスには、ヒトコロナウイルス 229E (HCoV-229E)、イヌコロナウイルス (CCoV)、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス (FIPV)、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス (TGEV)、ブタ流行性下痢ウイルス (PEDV)、ヒトコロナウイルス OC43 (HcoV-OC43) が含まれます。 、ウシコロナウイルス（BCoV）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（HEV）、ラット唾液腺炎ウイルス（SDAV）、マウス肝炎ウイルス（MHV）、七面鳥コロナウイルス（TCoV）、および鳥伝染性気管支炎ウイルス（IBV-Avian）（Fields et al.フィールズ ウイルス学編、 第 3 版、レイブンプレス、フィラデルフィア、1323 ～ 1341 年、1996 年; マヘイおよびコリアー編、 微生物学および微生物感染症 、第 1 巻ウイルス学、9 番目 版、オックスフォード大学出版局、463–479、1998）。
コロナウイルス感染症は一般に、感染力と臨床症状に関して宿主特異的です。 コロナウイルスはさらに顕著な組織指向性を示します。 不適切な宿主種または組織型に感染すると、感染不全、変異ウイルスの産生、および病原性の変化が生じる可能性があります。 コロナウイルスは一般に細胞培養ではうまく増殖せず、ヒトコロナウイルス感染の動物モデルは不足しています。 したがって、それらについてはほとんど知られていません（Fields et al. eds. Fields Virology、 第 3 版、Raven Press、フィラデルフィア、1323 ～ 1341 年、1996 年）。 既知のヒトコロナウイルスは細胞培養に特にこだわりがあり、増殖には選択された細胞株、器官培養、または哺乳マウスを好みます。 細胞培養で増殖したコロナウイルスは、宿主細胞の種類と培養条件に応じて、さまざまな程度の病原性および/または細胞変性効果 (CPE) を示します。 Vero E6 細胞内で増殖することが示されている唯一のヒトまたは動物のコロナウイルスは PEDV であり、Vero E6 細胞内で増殖するには培地にトリプシンを添加する必要があります。 さらに、Vero E6 細胞培養に適応した PEDV は、細胞質空胞と大きな合胞体の形成を伴う、著しく異なる CPE をもたらします (Hofmann および Wyler、 Ｊ．クリン． マイクロ。 26:2235–39、1988; 草薙ら、 Ｊ．Ｖｅｔ． Med. Sci. 554:313–18、1991)。
コロナウイルスが人間に重篤な疾患を引き起こすことはこれまで知られていなかったが、風邪を含む上気道疾患の主な原因であることが確認されている。 ヒトにおける反復感染は血清型内および血清型間で一般的であり、ヒトにおけるコロナウイルス感染に対する免疫反応が不完全であるか、または短命であることを示唆しています。 動物のコロナウイルス感染は重度の腸疾患や呼吸器疾患を引き起こす可能性があります。 ワクチン接種は、動物における一部のコロナウイルス感染症を予防および制御するために成功裏に使用されています。 動物特有のコロナウイルスが重篤な疾患を引き起こす能力があることから、コロナウイルスが人間にもより重篤な疾患を引き起こす可能性がある（Fields et al. eds. Fields Virology、第 3 版、 Raven Press、フィラデルフィア、1323 ～ 1341、1996; Mahey およびCollier eds. 微生物学と微生物感染症 、第 1 巻、ウイルス学、9 番目 版、オックスフォード大学出版局、463–479、1998）。
2002年後半、病因が特定できない生命を脅かす呼吸器疾患の症例が中国の広東省から報告され、続いてベトナム、カナダ、香港からも家族や医療従事者に広がった重度の発熱性呼吸器疾患の報告があった。 この症候群は、2003 年 2 月に疾病管理予防センターによって「重症急性呼吸器症候群」(SARS) と指定されました ( MMWR、 52:241–48、2003)。
ヒトのコロナウイルス感染症の迅速診断とワクチンを開発するこれまでの取り組みは、適切な研究モデルの欠如とヒトの疾患の経過が中程度であることにより妨げられてきた。 したがって、迅速な診断検査とワクチンの必要性が存在します。
開示内容の概要
新たに分離されたヒトコロナウイルスは SARS の原因物質として特定され、SARS-CoV と呼ばれています。 SARS-CoVゲノムの核酸配列およびSARS-CoVオープンリーディングフレームのアミノ酸配列が本明細書に提供される。
本開示は、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ核酸の存在を検出すること、および／または対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染を診断することにおいて有用な方法および組成物を提供する。 また、サンプル中のSARS-CoV抗原もしくは抗体の存在を検出すること、および/または対象におけるSARS-CoV感染症を診断することにおいて有用な方法および組成物も提供される。
前述および他の特徴および利点は、添付の図面を参照して進むいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
図面の簡単な説明
図１〜図４ 1A～B コロナウイルス分離株およびSARS患者からの血清で見られる典型的な初期細胞変性効果を示す顕微鏡写真である。 イチジク。 1A 図は、SARS患者の中咽頭標本を接種したVero E6細胞の顕微鏡写真(×40)である。 イチジク。 1B 図は、間接蛍光抗体（IFA）アッセイにおいて回復期SARS患者の血清と反応する感染Vero E6細胞の顕微鏡写真（×400）である。
図１〜図４ 2A-B SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)の超微細構造特徴を示す電子顕微鏡写真である。 イチジク。 2A 図は、粒子が槽内に出芽する際の、粗面小胞体の膜（矢印）に沿って整列したウイルスヌクレオカプシドの薄切片電子顕微鏡写真である。 エンベロープされたビリオンは、表面突起 (矢じり) と電子透過性の中心を持っています。 ウイルスエンベロープの直下には、らせん状のヌクレオカプシドによって形成された特徴的なリングがあり、これは断面でよく見られます。 イチジク。 2B ネガティブ染色（タングステン酸メチルアミン）の電子顕微鏡写真であり、典型的な内部螺旋ヌクレオカプシド様構造と粒子の周囲を取り囲む棍棒状の表面突起を備えた、染色が浸透したコロナウイルス粒子を示しています。 バー: 100 nm。
イチジク。 3 これは、SARS-CoV と他のヒトおよび動物のコロナウイルスとの間の推定系統関係を示す推定最大節約ツリーです。 系統発生的関係は、コロナウイルスポリメラーゼ遺伝子ORF1b (配列番号1の核酸15,173～15,578)の405ヌクレオチドの配列アラインメントに基づいている。 HcoV-229E、CCoV、FIPV、TGEV、PEDV、HcoV-OC43、BCoV、HEV、SDAV、MHV、TCoV、および IBV-Avian に代表される 3 つの主要なコロナウイルス抗原グループ (I、II、III) を網掛けで示しています。 。 50% 多数決ルールのコンセンサス ツリーから得られたブートストラップ値 (100 回の反復) が、系統図の主要な内部分岐にプロットされます。 分岐の長さはヌクレオチドの違いに比例します。
イチジク。 4 図は、SARS-CoV と他のヒトおよび動物のコロナウイルスとの間の推定系統関係を示す、隣接するツリーを結合した図です。 示された SARS-CoV タンパク質のアミノ酸配列を、完全なゲノム配列情報が入手可能なコロナウイルスの 3 つのグループ [グループ 1: HCoV-229E (AF304460); PEDV (AF353511); TGEV (AJ271965); グループ 2: BCoV (AF220295); MHV (AF201929); グループ 3: 感染性気管支炎ウイルス (M95169)]。 部分的な配列情報が利用可能な他のコロナウイルス種の代表的な株の配列は、構造タンパク質の比較の一部に含まれていました [グループ 1: CCoV (D13096); FCoV (AY204704); ブタ呼吸器コロナウイルス (Z24675); グループ 2: HCoV-OC43 (M76373、L14643、M93390)。 HEV (AY078417); ラットコロナウイルス（AF207551）]。 配列アラインメントと隣接結合ツリーは、Gonnet タンパク質比較マトリックスを備えた Clustalx 1.83 を使用して生成されました。 結果として得られたツリーは、treetool 2.0.1 を使用して最終出力用に調整されました。
図１〜図４ 5A～C SARS 患者のびまん性肺胞損傷を示す顕微鏡写真です ( 図１〜図４ 5A-B )、および SARS-CoV に感染した Vero E6 細胞の免疫組織化学的染色 ( イチジク。 5C ). イチジク。 5A SARS患者の肺組織の顕微鏡写真(×50)である。 びまん性の肺胞損傷、豊富な泡状マクロファージおよび多核合胞体細胞が存在します。 ヘマトキシリン・エオシン染色を使用した。 イチジク。 5B 図は、同じ SARS 患者の肺組織の高倍率顕微鏡写真 (×250) です。 合胞体細胞には目立ったウイルス封入体は見られません。 イチジク。 5C 免疫組織化学的に染色されたSARS-CoV感染細胞の顕微鏡写真(×250)である。 個々のベロ E6 細胞および合胞体のベロ E6 細胞の膜および細胞質の免疫染色は、ネコ抗 FIPV-1 腹水を使用して達成されました。 ナフトールファストレッド基質およびヘマトキシリン対比染色を備えた免疫アルカリホスファターゼを使用しました。
イチジク。 6A-B 図２は、ＳＡＲＳ患者の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中のコロナウイルス感染細胞の超微細構造特徴を示す電子顕微鏡写真である。 イチジク。 6A コロナウイルスに感染した細胞の電子顕微鏡写真です。 多数の細胞内および細胞外粒子が存在します。 ビリオンは矢印で示されています。 イチジク。 6B 図の矢印の部分の高倍率電子顕微鏡写真です。 イチジク。 6A （時計回りに約90°回転）。 バー: イチジク。 6A 、1μm。 イチジク。 6B 、100nm。
図１〜図４ 7A～C SARS-CoV ゲノムの構成を示しています。 イチジク。 7A 図は、29,727 nt SARS-CoV ゲノム RNA の全体的な構成を示す図です。 72 nt のリーダー配列は、左端の小さな長方形として表されます。 非構造ポリタンパク質をコードする ORF1a および 1b、および S、E、M、および N 構造タンパク質をコードする ORF が示されています。 ボックスの垂直位置は、リーディング フレームのフェーズを示します (線の上のタンパク質はフェーズ 1、線の上のタンパク質はフェーズ 2、線の下のタンパク質はフェーズ 3)。 イチジク。 7B 構造タンパク質コード領域および予測されるmRNA転写物の拡大図である。 既知の構造タンパク質をコードする領域 (濃い灰色のボックス) と、潜在的な産物 X1 ～ X5 の領域およびリーディング フレーム (薄い灰色のボックス) が示されています。 保存された転写調節配列の同定によって予測されるように、SARS-CoVによって発現される3'共末端mRNAの長さとマップ位置が示されている。 イチジク。 7C SARS-CoV mRNAのノーザンブロット分析を示すナイロン膜のデジタル画像です。 感染した Vero E6 細胞からの Poly(A)+ RNA をホルムアルデヒド アガロース ゲルで分離し、ナイロン膜に転写し、3' 非翻訳領域と重なるジゴキシゲニン標識リボプローブとハイブリダイズさせました。 シグナルは化学発光によって視覚化されました。 SARS-CoV mRNA のサイズは、分子量マーカーの対数直線フィットからの外挿によって計算されました。 レーン 1、SARS-CoV mRNA。 レーン 2、Vero E6 細胞 mRNA。 レーン 3、分子量マーカー、サイズ (kB)。
配列表
添付の配列表に記載されている核酸およびアミノ酸配列は、37 CFR 1.822 で定義されているように、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語とアミノ酸の 3 文字コードを使用して示されています。 各核酸配列の１つの鎖だけが示されているが、相補鎖は、表示された鎖へのいかなる言及によっても含まれるものとして理解される。 添付の配列リストでは次のようになります。
配列番号１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶゲノムの核酸配列を示す。
配列番号２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶポリタンパク質１ａのアミノ酸配列を示す（配列番号１の核酸２６５～核酸１３，３９８によってコードされる）。
配列番号３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶポリタンパク質１ｂのアミノ酸配列を示す（配列番号１の核酸１３，３９８～２１，４８２によってコードされる）。
配列番号４は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｓタンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号１の核酸２１，４９２〜２５，２５６によってコードされる）。
配列番号５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｘ１タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号１の核酸２５，２６８～２６，０８９によってコードされる）。
配列番号６は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｘ２タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号１の核酸２５，６８９〜２６，１５０によってコードされる）。
配列番号７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｅタンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号１の核酸２６，１１７～２６，３４４によってコードされる）。
配列番号８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｍタンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号１の核酸２６，３９８～２７，０６０によってコードされる）。
配列番号９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｘ３タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号１の核酸２７，０７４～２７，２６２によってコードされる）。
配列番号１０は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｘ４タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号１の核酸２７，２７３〜２７，６３８によってコードされる）。
配列番号１１は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｘ５タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号１の核酸２７，８６４〜２８，１１５によってコードされる）。
配列番号１２は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｎタンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号１の核酸２８，１２０〜２９，３８５によってコードされる）。
配列番号13～15は、いくつかのSARS-CoV特異的オリゴヌクレオチドプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１６〜３３は、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）ＳＡＲＳ−ＣｏＶアッセイに使用されるいくつかのオリゴヌクレオチドプライマー／プローブの核酸配列を示す。
配列番号３４〜３５は、保存されたコロナウイルスアミノ酸モチーフをコードする部位にアニールするように設計された２つの縮重プライマーの核酸配列を示す。
配列番号３６〜３８は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて対照として使用されるいくつかのオリゴヌクレオチドプライマー／プローブの核酸配列を示す。
いくつかの実施形態の詳細な説明
I. 略語
母： コロナウイルス膜タンパク質 N: コロナウイルス核タンパク質 ORF: 読書枠を開く PCR ポリメラーゼ連鎖反応 人種： cDNA 末端の 5' 高速増幅 RT-PCR: 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 S: コロナウイルススパイクタンパク質 サーズ: 重症急性呼吸器症候群 SARS-CoV: 重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス TRS: 転写調節配列
II. 条項
特に断りのない限り、専門用語は従来の用法に従って使用されます。 分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin、 Genes VII 、Oxford University Press、2000 (ISBN 019879276X) に記載されています。 ケンドリューら。 (編集)、 分子生物学百科事典 、Blackwell Publishers 発行、1994 (ISBN 0632021829)。 およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ（編）、「 分子生物学およびバイオテクノロジー：総合デスクリファレンス」 、Ｗｉｌｅｙ、Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．発行、１９９５年（ＩＳＢＮ ０４７１１８６３４１）。 およびその他の同様の参考文献。
本明細書で使用される場合、単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。 同様に、文脈で明確に別段の指示がない限り、「または」という単語には「および」が含まれることが意図されています。 また、本明細書で使用される場合、用語「含む」は「含む」を意味する。 したがって、「AまたはBを含む」とは、A、B、またはAおよびBを含むことを意味する。さらに、核酸またはポリペプチドについて与えられるすべてのヌクレオチドサイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量値は近似値であることが理解されるべきである。 、および は説明のために提供されています。 本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に説明する。 本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。 矛盾がある場合には、用語の説明を含む本明細書が優先するものとします。 さらに、材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定することを意図したものではない。
本開示のさまざまな実施形態の検討を容易にするために、特定の用語について以下に説明する。
アジュバント: 抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する物質。 ヒトで使用するためのワクチンアジュバントの開発については、Singh et al. で概説されています。 （ Nat. Biotechnol. 17:1075–1081, 1999）は、その出版時に、アルミニウム塩とMF59マイクロエマルションがヒトへの使用が承認された唯一のワクチンアジュバントであることを開示している。
増幅：核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）の増幅とは、サンプル中の核酸分子のコピー数を増加させる実験室技術の使用を指す。 増幅の例はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）であり、サンプル中の核酸テンプレートへのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、サンプルを一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させます。 プライマーは適切な条件下で伸長され、鋳型から解離され、再アニーリングされ、伸長され、解離されて核酸のコピー数が増幅されます。 増幅産物は、電気泳動、制限エンドヌクレアーゼ切断パターン、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションまたはライゲーション、および／または核酸配列決定などの技術によって特徴付けることができる。
増幅方法の他の例としては、米国特許第５，６０１，１１０号に開示されている鎖置換増幅が挙げられる。 米国特許第５，７４４，３１１号； 米国特許第５，６１１，１１３号に開示されているような、転写のない等温増幅。 米国特許第6,033,881号。 修復連鎖反応増幅、WO 90/01069に開示されている。 EP-A-320,308に開示されているリガーゼ連鎖反応増幅。 ギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅。 米国特許第5,427,930号。 ＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ転写を伴わない増幅（米国特許第５，６０１，１１０号に開示されている）。 米国特許第6,025,134号。 増幅方法は、例えば追加のステップまたは増幅を別のプロトコールと組み合わせるなど、変更することができる。
動物: 生きている多細胞脊椎動物。たとえば、哺乳類や鳥類が含まれるカテゴリーです。 哺乳類という用語には、ヒトおよびヒト以外の哺乳類の両方が含まれる。 同様に、「対象」という用語には、ヒトおよび獣医学的対象の両方、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれる。
抗体：免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質（またはタンパク質複合体）。 認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子のほか、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれます。 軽鎖はカッパまたはラムダに分類されます。 重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、それぞれ免疫グロブリン クラス、IgG、IgM、IgA、IgD、および IgE を定義します。
免疫グロブリン（抗体）の基本的な構造単位は、一般に四量体です。 各四量体は 2 つの同一のポリペプチド鎖ペアで構成され、各ペアは 1 本の「軽」鎖 (約 25 kDa) と 1 本の「重」鎖 (約 50 ～ 70 kDa) を持ちます。 各鎖の N 末端は、主に抗原認識に関与する約 100 ～ 110 個以上のアミノ酸の可変領域を定義します。 )という用語は 「可変軽鎖」(V L )および「可変重鎖」(V H 、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。
本明細書で使用される「抗体」という用語には、完全な免疫グロブリンだけでなく、十分に特徴付けられた多くの断片が含まれる。 例えば、標的タンパク質（またはタンパク質もしくは融合タンパク質内のエピトープ）に結合するＦａｂ、Ｆｖ、および単鎖Ｆｖ（ＳＣＦｖ）も、そのタンパク質（またはエピトープ）に対する特異的結合剤となるであろう。 これらの抗体フラグメントは次のように定義されます。 (1) Fab、酵素パパインによる抗体全体の消化によって無傷の軽鎖と 1 本の重鎖の一部を生成することによって生成される抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含むフラグメント; (2) Fab'、抗体全体をペプシンで処理し、続いて還元して無傷の軽鎖と重鎖の一部を生成することによって得られる抗体分子のフラグメント。 抗体分子ごとに 2 つの Fab' フラグメントが得られます。 (3) (Fab') 2 、その後の還元を行わずに抗体全体を酵素ペプシンで処理することによって得られる抗体の断片。 （４）Ｆ（ａｂ'） ２ 、２つのジスルフィド結合によって結合された２つのＦａｂ'フラグメントの二量体。 （５）Ｆｖ、２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された断片。 (6) 一本鎖抗体、遺伝子操作された分子で、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含み、遺伝子的に融合された一本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結されている。 これらのフラグメントを作成する方法は日常的なものです (たとえば、Harlow と Lane、 抗体の使用: 実験マニュアル 、CSHL、ニューヨーク、1999)。
本開示の方法および装置で使用するための抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。 単なる例として、モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilsteinの古典的方法( Nature 256:495-97, 1975)またはその派生方法に従ってマウスハイブリドーマから調製することができる。 モノクローナル抗体産生の詳細な手順は、Harlow and Lane著「 Using Antibodies: A Laboratory Manual」 、CSHL、ニューヨーク、1999年に記載されている。
抗原：動物における抗体の産生またはT細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質（動物に注射または吸収される組成物を含む）。 抗原は、異種免疫原によって誘導されるものを含む、特定の体液性免疫または細胞性免疫の産物と反応します。 一実施形態では、抗原はコロナウイルス抗原である。
結合または安定な結合：オリゴヌクレオチドは、その結合の検出を可能にするのに十分な量のオリゴヌクレオチドが塩基対を形成するか、その標的核酸にハイブリダイズする場合、標的核酸に結合するか、または安定に結合する。 結合は、標的:オリゴヌクレオチド複合体の物理的特性または機能的特性によって検出できます。 標的とオリゴヌクレオチドとの間の結合は、機能的結合アッセイまたは物理的結合アッセイを含む、当業者に知られている任意の手順によって検出することができる。 結合は、結合が遺伝子の発現、DNA複製、転写、翻訳などの生合成プロセスに観察可能な影響を与えるかどうかを決定することによって機能的に検出することができる。
DNAまたはRNAの相補鎖の結合を検出する物理的方法は当技術分野で周知であり、DNase Iまたはケミカルフットプリンティング、ゲルシフトおよびアフィニティー切断アッセイ、ノーザンブロッティング、サザンブロット、ドットブロッティング、および光吸収などの方法が含まれる。検出手順。 例えば、オリゴヌクレオチド（またはアナログ）と標的核酸を含む溶液の温度変化に伴う220～300nmにおける吸光度の変化を観察する方法は、簡便かつ確実であるため広く用いられている。徐々に増えていきました。 オリゴヌクレオチドまたは類似体がその標的に結合すると、オリゴヌクレオチド（または類似体）と標的が解離または融解するにつれて、特有の温度で吸収が突然増加します。
オリゴマーとその標的核酸の間の結合は、多くの場合、 温度 (T m オリゴマーの 50% がその標的から融解する ) によって特徴付けられます。 より高いＴ ｍ は、 を有する複合体と比較して、より強力な、またはより安定な複合体を意味する より低いＴ ｍ 。
cDNA (相補的 DNA): 内部の非コード セグメント (イントロン) と転写を決定する制御配列を欠く DNA 片。 cDNAは、細胞から抽出されたメッセンジャーRNAからの逆転写によって研究室で合成されます。
電気泳動: 電気泳動とは、電場の影響下で液体媒体中で帯電した溶質または粒子が移動することを指します。 電気泳動による分離は、高分子の分析に広く使用されています。 特に重要なのは、タンパク質と核酸配列の同定です。 このような分離は、サイズおよび/または電荷の違いに基づく可能性があります。 ヌクレオチド配列は均一な電荷を持っているため、サイズの違いに基づいて分離されます。 電気泳動は、支持されていない液体媒体中で実行することもできますが (キャピラリー電気泳動など)、より一般的には液体媒体は固体支持媒体を通過します。 最も広く使用されている支持媒体は、ポリアクリルアミドやアガロースゲルなどのゲルです。
ふるいゲル (アガロースなど) は分子の流れを妨げます。 ゲルの孔径によって、ゲル中を自由に流れることができる分子のサイズが決まります。 分子のサイズが大きくなるにつれて、ゲル中を移動する時間も長くなります。 その結果、小さな分子は大きな分子よりも早くゲル中を移動するため、一定の時間内に大きな分子よりもサンプル塗布領域からさらに遠くに進みます。 このようなゲルは、サイズに基づいたヌクレオチド配列の分離に使用されます。
に反比例する移動度でアガロースゲル中を移動します log 10 直鎖状 DNA の断片は、分子量の 。 異なる濃度のアガロースを含むゲルを使用することにより、異なるサイズの DNA 断片を分離できます。 アガロース濃度が高いと小さな DNA の分離が容易になり、アガロース濃度が低いと大きな DNA の分離が可能になります。
ハイブリダイゼーション：オリゴヌクレオチドとその類似体は、相補的塩基間のワトソン・クリック水素結合、フーグスティーン水素結合、または逆フーグスティーン水素結合を含む水素結合によってハイブリダイズします。 一般に、核酸はピリミジン (シトシン (C)、ウラシル (U)、チミン (T)) またはプリン (アデニン (A) およびグアニン (G)) のいずれかの窒素含有塩基で構成されます。 これらの窒素含有塩基は、ピリミジンとプリンの間に水素結合を形成し、ピリミジンとプリンの結合は「塩基対形成」と呼ばれます。 より具体的には、AはTまたはUに水素結合し、GはCに結合します。「相補的」とは、異なる核酸配列間、または同じ核酸配列の2つの異なる領域間で生じる塩基対形成を指します。
「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的」は、オリゴヌクレオチド（またはその類似体）とＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間で安定かつ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性を示す用語である。 オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的配列に対して１００％相補的である必要はない。 オリゴヌクレオチドまたは類似体は、標的 DNA または RNA 分子へのオリゴヌクレオチドまたは類似体の結合が標的 DNA または RNA の正常な機能を妨げ、オリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合、特異的にハイブリダイズ可能です。または、特異的結合が望まれる条件下、例えば、インビボアッセイまたはシステムの場合の生理学的条件下で、非標的配列に対する類似体。 このような結合は、特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれます。
特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択したハイブリダイゼーション方法の性質、およびハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変化するであろう。 一般に、ハイブリダイゼーションの温度とイオン強度 (特に Na + および/またはマグネシウム ++ ハイブリダイゼーションバッファーの濃度) によってハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決まりますが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響します。 特定の程度のストリンジェンシーを達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook et al. によって議論されています。 (編)、 分子クローニング: 実験マニュアル、 2 nd 編、vol. 1–3、コールド スプリング ハーバー研究所出版局、コールド スプリング ハーバー、ニューヨーク州、1989 年、第 9 章および第 11 章。 およびオースベルら。 分子生物学の短いプロトコル、 4 番目 編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社；
本開示の目的上、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子と標的配列との間に２５％未満のミスマッチがある場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。 「厳密な条件」は、より正確に定義するために特定の厳密さのレベルに分類される場合があります。 したがって、本明細書で使用される「中程度のストリンジェンシー」条件とは、25%を超える配列不一致を有する分子がハイブリダイズしない条件である。 「中ストリンジェンシー」の条件は、15%を超えるミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高ストリンジェンシー」の条件は、10%を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。 「非常に高いストリンジェンシー」の条件とは、ミスマッチが 6% を超える配列がハイブリダイズしない条件です。
免疫刺激組成物：脊椎動物における特定の免疫応答（または免疫原性応答）を刺激または誘発するのに有用な組成物を意味するために本明細書で使用される用語。 いくつかの実施形態では、免疫原性応答は、脊椎動物がワクチンの対象となる生物への感染または生物からの疾患の進行に対してよりよく抵抗できるようにするという点で、防御的であるか、または防御免疫を提供する。
特定の理論に束縛されるものではないが、免疫原性応答は、免疫刺激組成物中に提供される１つ以上のエピトープに特異的な抗体の生成から生じ得ると考えられる。 あるいは、応答は、免疫刺激性組成物中に提供される１つ以上のエピトープに対するＴヘルパーまたは細胞傷害性細胞に基づく応答を含み得る。 これら 3 つの応答はすべて、ナイーブ細胞または記憶細胞に由来している可能性があります。 免疫刺激組成物のタイプの具体的な一例はワクチンである。
いくつかの実施形態では、免疫刺激組成物の「有効量」または「免疫刺激量」は、対象に投与された場合に、検出可能な免疫応答を引き起こすのに十分な量である。 このような応答には、例えば、免疫刺激組成物中に提供される１つ以上のエピトープに特異的な抗体の生成が含まれ得る。 あるいは、応答は、免疫刺激組成物中に提供される１つ以上のエピトープに対するＴヘルパーまたはＣＴＬに基づく応答を含み得る。 これら 3 つの応答はすべて、ナイーブ細胞または記憶細胞に由来している可能性があります。 他の実施形態では、免疫刺激組成物の「保護有効量」は、対象に投与された場合に、対象に保護免疫を与えるのに十分な量である。
疾患の阻害または治療：例えば、SARSなどの疾患のリスクがある対象において、疾患または状態の完全な進行を阻害する。 「治療」とは、病気または病理学的状態が発症し始めた後に、その徴候または症状を改善する治療的介入を指す。 本明細書で使用される場合、疾患、病理学的状態または症状に関して「改善する」という用語は、観察可能な治療の有益な効果を指す。 有益な効果は、例えば、感受性の高い対象における疾患の臨床症状の発症の遅延、疾患の一部またはすべての臨床症状の重症度の軽減、疾患の進行の遅延、症状の軽減によって証明され得る。疾患の再発の数、対象の全体的な健康状態または福祉の改善、または特定の疾患に特有の当技術分野で周知の他のパラメータによる。
単離：「単離された」微生物（ウイルス、細菌、真菌、原生動物など）は、異なる種類、菌株、または種の微生物から実質的に分離または精製されています。 微生物は、段階希釈や培養などのさまざまな技術によって単離できます。
「単離された」生物学的構成要素（核酸分子、タンパク質、細胞小器官など）は、その構成要素が自然に存在する生物の細胞内の他の生物学的構成要素（他の染色体および染色体外など）から実質的に分離または精製されています。 DNA と RNA、タンパク質、細胞小器官。 「単離」された核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。 この用語はまた、宿主細胞内での組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸またはタンパク質、あるいはそれらの断片も包含する。
標識: 別の分子に直接的または間接的に結合して、その分子の検出を容易にする検出可能な化合物または組成物。 標識の具体的な非限定的な例としては、蛍光タグ、酵素結合、および放射性同位体が挙げられる。
核酸分子：ヌクレオチドのポリマー形態。これには、RNA、cDNA、ゲノムDNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方、および上記の合成形態および混合ポリマーが含まれます。 ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型を指します。 本明細書において使用される「核酸分子」は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。 核酸分子は、特に指定しない限り、通常、長さが少なくとも10塩基である。 この用語には、一本鎖および二本鎖の DNA が含まれます。 ポリヌクレオチドは、天然に存在するおよび／または非天然に存在するヌクレオチド結合によって一緒に結合された天然に存在するヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。
オリゴヌクレオチド：一般に 300 塩基以下の長さからなる核酸分子。 この用語はしばしば一本鎖デオキシリボヌクレオチドを指しますが、特に一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、RNA:DNA ハイブリッド、二本鎖 DNA なども指す場合があります。 「オリゴヌクレオチド」という用語には、オリゴヌクレオシド（すなわち、オリゴヌクレオチドからリン酸を除いたもの）および他の有機ベースポリマーも含まれる。 いくつかの例では、オリゴヌクレオチドは、長さが約10〜約90塩基、例えば、長さが12、13、14、15、16、17、18、19または20塩基である。 他のオリゴヌクレオチドは、長さが約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60塩基、約65塩基、約70塩基、約75塩基または約80塩基である。 オリゴヌクレオチドは、例えばプローブまたはプライマーとして使用するために一本鎖であってもよく、または例えば突然変異遺伝子の構築に使用するために二本鎖であってもよい。 オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかであり得る。 オリゴヌクレオチドは、核酸分子に関して上で論じたように修飾することができる。 オリゴヌクレオチドは、既存の核酸源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から得ることができるが、合成することもできる（例えば、実験室またはインビトロのオリゴヌクレオチド合成によって生成する）。
オープン リーディング フレーム (ORF): 内部終止コドンを持たず、アミノ酸をコードする一連のヌクレオチド トリプレット (コドン)。 これらの配列は通常、ペプチド/ポリペプチド/タンパク質/ポリタンパク質に翻訳可能です。
作動可能に連結される：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結される。 例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。 一般に、作動可能に連結された DNA 配列は連続しており、2 つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合には、同じ読み取りフレーム内にあります。 イントロンが存在する場合、機能的に結合された DNA 配列は連続していない可能性があります。
薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体は従来のものである。 Remington's Pharmaceutical Sciences 、EW Martin著、Mack Publishing Co.、イーストン、ペンシルベニア州、第15版(1975年)には、1つ以上のSARS-CoV核酸などの1つ以上の治療用化合物または分子の医薬送達に適した組成物および製剤が記載されている。酸分子、これらのタンパク質に結合するタンパク質または抗体、および追加の薬剤。
一般に、担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存する。 例えば、非経口製剤は通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、ブドウ糖水溶液、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容される流体をビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。 固体組成物（例えば、粉末、丸薬、錠剤、またはカプセル形態）の場合、従来の非毒性固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。 生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどの少量の非毒性補助物質を含有することができる。
ポリペプチド: モノマーがアミド結合を介して結合したアミノ酸残基であるポリマー。 アミノ酸がα-アミノ酸である場合、L-光学異性体またはD-光学異性体のいずれかを使用することができ、L-異性体が好ましい。 本明細書で使用される「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、任意のアミノ酸配列を包含することを意図しており、糖タンパク質などの修飾された配列を含む。 「ポリペプチド」という用語は、特に、天然に存在するタンパク質、ならびに組換えまたは合成により生成されるタンパク質を包含することを意図している。
保存的アミノ酸置換は、行われた場合に元のタンパク質の特性への干渉が最も少ない置換、つまり、タンパク質の構造、特に機能が保存され、そのような置換によって大きく変化しない置換です。 保存的置換の例を以下に示します。
元の残留物 保守的な置換 土地 することが 引数 ライト アスン グレン、彼の アスプ グル シシス することが グレン アスン グル アスプ 彼の アスン; グレン と ヴァル・レウ レオ イル; ヴァル ライト 引数; グレン; グル の リュー; の中に フェ 会った。 リュー; ブル することが Thr Thr することが トリップ ティール ティール トリプ; フェ ヴァル の中に; あなた
保存的置換は一般に、(a) 置換領域のポリペプチド主鎖の構造、たとえばシートまたはらせん構造、(b) 標的部位の分子の電荷または疎水性、または (c)側鎖の大部分。
一般に、タンパク質の特性に最大の変化をもたらすと予想される置換は、非保存的である。たとえば、(a) セリルまたはスレオニルなどの親水性残基が疎水性残基に（または疎水性残基によって）置換される置換である。例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル； (b) システインまたはプロリンが他の残基と（または他の残基によって）置換されている。 (c) 電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、またはヒスタジルが、電気陰性残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルと置換される(または電気陰性残基によって)。 または、(d) かさばる側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を持たない残基、例えばグリシンの代わりに(またはそれによって)置換される。
プローブおよびプライマー: プローブは、検出可能な標識または他のレポーター分子に結合した単離された核酸を含みます。 典型的な標識には、放射性同位体、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光剤または蛍光剤、ハプテン、および酵素が含まれます。 ラベル付けの方法およびさまざまな目的に適したラベルの選択に関するガイダンスは、例えば、Sambrook et al. (編)、 分子クローニング: 実験マニュアル、 2 nd 編、vol. 1–3、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールド スプリング ハーバー、ニューヨーク州、1989 年および Ausubel et al. 分子生物学の短いプロトコル、 4 番目 編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社；
プライマーは短い核酸分子、例えば長さが10ヌクレオチド以上のDNAオリゴヌクレオチドであり、例えば連続する相補的ヌクレオチドまたは増幅される配列にハイブリダイズする。 より長いDNAオリゴヌクレオチドは、長さが約15、20、25、30または50ヌクレオチド以上であってもよい。 プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的 DNA 鎖にアニーリングして、プライマーと標的 DNA 鎖の間にハイブリッドを形成し、その後、プライマーは DNA ポリメラーゼ酵素によって標的 DNA 鎖に沿って伸長されます。 プライマー対は、例えば、上述のように、ＰＣＲまたは当技術分野で公知の他の核酸増幅法による核酸配列の増幅に使用することができる。
核酸プローブおよびプライマーを調製および使用する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． (編)、 分子クローニング: 実験マニュアル、 2 nd 編、vol. 1–3、コールド スプリング ハーバー研究所出版局、コールド スプリング ハーバー、ニューヨーク州、1989 年。 オースベルら。 分子生物学の短いプロトコル、 4 番目 編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社、1999年。 そしてイニスら。 PCR Protocols、A Guide to Methods and Applications 、Academic Press, Inc.、San Diego、CA、1990。増幅プライマー対は、例えば、Primer (バージョン 0.5、© 1991、ホワイトヘッド生物医学研究所、マサチューセッツ州ケンブリッジ）。 当業者であれば、特定のプローブまたはプライマーの特異性がその長さに応じて増加することを理解するであろう。 したがって、より高い特異性を得るために、標的ヌクレオチド配列の少なくとも20、25、30、35、40、45、50またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーを選択することができる。
タンパク質: 遺伝子によって発現され、アミノ酸で構成される生体分子、特にポリペプチド。 「ポリタンパク質」は、合成後に切断されて機能的に異なるいくつかのポリペプチドを生成するタンパク質です。
精製: 「精製」という用語は絶対的な純度を必要としません。 むしろ、相対的な用語として意図されています。 したがって、例えば、精製タンパク質調製物は、対象となるタンパク質が細胞内の自然環境よりも純粋であるものである。 一般に、タンパク質調製物は、そのタンパク質が調製物の総タンパク質含有量の少なくとも50%を占めるように精製される。
組換え核酸：天然に存在しない配列、または配列の別個の 2 つのセグメントを人為的に組み合わせて作られた配列を有する配列。 この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成によって、またはより一般的には、核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えば、Sambrook et al.に記載されているような遺伝子工学技術によって達成される。 (編)、 分子クローニング: 実験マニュアル、 2 nd 編、vol. 組換えという用語には、核酸の一部の付加、置換、または欠失のみによって改変された核酸が含まれる。
サンプル: 全体を代表する部分、部分、またはセグメント。 この用語には、動物、植物、環境から得られるサンプルなど、あらゆる物質が含まれます。
「環境サンプル」には、屋内または屋外環境内の無生物または貯留層から得られたサンプルが含まれます。 環境サンプルには、土壌、水、塵、空気のサンプルが含まれますが、これらに限定されません。 建材、家具、埋立地の内容物を含むバルクサンプル。 動物の排泄物、収穫された穀物、食料品などのその他の貯留層サンプル。
「生体サンプル」とは、植物または動物の対象から得られるサンプルである。 本明細書で使用される場合、生物学的サンプルには、対象におけるウイルス感染の検出に有用なすべてのサンプルが含まれる。 血液の派生物および分画（血清など）。 抽出された胆汁。 生検または外科的に除去された組織（例えば、固定されていない、凍結されている、ホルマリンで固定されている、および／またはパラフィンに包埋されている組織を含む）。 涙。 牛乳; 皮膚の擦り傷。 表面洗浄。 尿; 喀痰; 脳脊髄液; 前立腺液; 膿; 骨髄を吸引する。 バル; 唾液; 子宮頸部スワブ; 膣綿棒; そして口腔咽頭洗浄。
配列同一性: 2 つの核酸配列または 2 つのアミノ酸配列間の類似性は、配列間の類似性の観点から表現され、配列同一性とも呼ばれます。 配列同一性は、同一性パーセント (または類似性または相同性) の観点から測定されることがよくあります。 パーセンテージが高いほど、2 つのシーケンスはより類似しています。
比較のために配列をアラインメントする方法は、当技術分野でよく知られている。 さまざまなプログラムと位置合わせアルゴリズムは次の文献に記載されています。Smith and Waterman ( Adv. Appl. Math.、 2:482、1981); Needleman および Wunsch ( J. Mol. Biol.、 48:443、1970)。 ピアソンとリップマン（ Proc. Natl. Acad. Sci.、 85:2444、1988）。 ヒギンズとシャープ ( Gene、 73:237–44、1988)。 ヒギンズとシャープ ( CABIOS、 5:151–53、1989)。 コーペットら。 ( Nuc. Acids Res.、 16:10881–90、1988)。 黄ら。 ( Comp. Appls Biosci.、 8:155–65、1992)。 およびピアソンら。 ( Meth. Mol. Biol.、 24:307–31、1994)。 アルトシュルら。 ( Nature Genet., 6:119–29, 1994) は、配列アラインメント法と相同性計算の詳細な考察を示しています。
アライメントツール ALIGN (Myers and Miller, CABIOS 4:11–17, 1989) または LFASTA (Pearson and Lipman, 1988) を使用して配列比較を実行できます (Internet Program© 1996, WR Pearson and the University of Virginia、「fasta20u63」) 」バージョン 2.0u63、リリース日は 1996 年 12 月）。 ALIGN は配列全体を相互に比較しますが、LFASTA は局所的な類似性のある領域を比較します。 これらの調整ツールとそれぞれのチュートリアルは、インターネットの NCSA Web サイトから入手できます。 あるいは、約 30 アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較の場合、デフォルトのパラメーターに設定されたデフォルトの BLOSUM62 マトリックス (ギャップ存在コスト 11、残基あたりのギャップコスト 11) を使用して「Blast 2 配列」機能を使用できます。 1)。 短いペプチド (約 30 アミノ酸未満) をアラインメントする場合、デフォルトのパラメーター (オープン ギャップ 9、エクステンション ギャップ 1 ペナルティ) に設定された PAM30 マトリックスを使用して、「Blast 2 シーケンス」機能を使用してアラインメントを実行する必要があります。 BLAST 配列比較システムは、たとえば NCBI の Web サイトから入手できます。 Altschul らも参照。 Ｊ．Ｍｏｌ． Biol.、 215:403–10、1990; ギッシュ。 および州、 Nature Genet.、 3:266–72、1993; マッデンら、 Ｍｅｔｈ． Enzymol.、 266:131–41、1996; Altschul et al.、 Nucleic Acids Res.、 25:3389–402、1997; および Zhang および Madden、 Genome Res.、 7:649–56、1997 年。
タンパク質のオルソログ（他の種のタンパク質と同等）は、場合によっては、デフォルトのパラメータに設定された ALIGN を使用して、特定のタンパク質のアミノ酸配列との全長アラインメントにわたってカウントされた 75% を超える配列同一性を保有することを特徴とします。 参照配列との類似性がさらに高いタンパク質は、この方法で評価すると、少なくとも 80%、少なくとも 85%、少なくとも 90%、少なくとも 92%、少なくとも 95%、または少なくともなど、増加する同一性パーセンテージを示します。 98% の配列同一性。 さらに、配列同一性は、開示された融合タンパク質の一方または両方の結合ドメインの全長にわたって比較することができる。
全配列よりも大幅に少ない配列が配列同一性について比較される場合、相同配列は通常、10 ～ 20 の短いウィンドウにわたって少なくとも 80% の配列同一性を有し、少なくとも 85%、少なくとも 90% の配列同一性を有する場合があります。参照配列との類似性に応じて、少なくとも 95%、または少なくとも 99%。 このような短いウィンドウにわたる配列同一性は、LFASTA を使用して決定できます。 方法については、NCSA Web サイトで説明されています。 当業者であれば、これらの配列同一性の範囲が指針としてのみ提供されることを理解するであろう。 提供された範囲外であっても、非常に重要な相同体が得られる可能性は十分にあります。 タンパク質について説明したのと同様の相同性の概念が核酸にも当てはまります。
2 つの核酸分子が密接に関連していることを示すもう 1 つの指標は、2 つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることです。 代表的なハイブリダイゼーション条件は上で議論されている。
高度の同一性を示さない核酸配列でも、遺伝暗号の縮重により、類似のアミノ酸配列をコードする場合があります。 この縮重を利用して核酸配列の変更を行い、それぞれが実質的に同じタンパク質をコードする複数の核酸配列を生成できることが理解される。
特異的結合剤: 定義された標的にのみ実質的に結合する薬剤。 したがって、タンパク質特異的結合剤は、実質的に規定のタンパク質のみに結合するか、タンパク質内の特定の領域に結合する。 本明細書で使用されるタンパク質特異的結合剤には、特定のポリペプチドに実質的に結合する抗体および他の薬剤が含まれる。 抗体は、ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ならびにその免疫学的に有効な部分（「断片」）であり得る。
特定の薬剤が実質的に特定のポリペプチドのみに結合するという決定は、日常的な手順を使用または適応させることによって容易に行うことができる。 １つの適切なインビトロアッセイは、ウエスタンブロッティング手順を利用する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、 Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、ＣＳＨＬ、ニューヨーク、１９９９年を含む多くの標準的なテキストに記載されている）。
形質転換された：「形質転換された」細胞とは、分子生物学技術によって核酸分子が導入された細胞である。 この用語は、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによる形質転換、エレクトロポレーション、リポフェクション、およびパーティクルガン加速による裸の DNA の導入など、核酸分子をそのような細胞に導入するすべての技術を包含します。
ベクター：宿主細胞に導入され、それによって形質転換された宿主細胞を産生する核酸分子。 ベクターは、複製起点など、宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含み得る。 ベクターはまた、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および当技術分野で知られている他の遺伝要素を含み得る。
ウイルス: 生きた細胞内で繁殖する微視的な感染性微生物。 ウイルスは通常、タンパク質のコートに囲まれた単一の核酸のコアから本質的に構成されており、生細胞内でのみ複製する能力を持っています。 「ウイルスの複製」とは、少なくとも 1 つのウイルスのライフサイクルの発生によって追加のウイルスが生成されることです。 ウイルスは宿主細胞の正常な機能を破壊し、ウイルスによって決定された方法で細胞を動作させる可能性があります。 たとえば、ウイルス感染により、感染していない細胞が通常は産生しない細胞がサイトカインを産生したり、サイトカインに応答したりすることがあります。
「コロナウイルス」は、人間や他の動物に呼吸器疾患や腸疾患を引き起こす、エンベロープを持った大型の RNA ウイルスです。 コロナウイルスのゲノムは、分節のない一本鎖のプラスセンス RNA で、長さは約 27 ～ 31 kb です。 ゲノムは 5' メチル化キャップと 3' ポリ A テールを持ち、mRNA として直接機能します。 宿主細胞の侵入はエンドサイトーシスと膜融合を介して起こり、細胞質内で複製が起こります。 最初に、ポジティブセンスゲノムの5' 20 kbが翻訳されてウイルスポリメラーゼが生成され、その後、転写物の「ネステッドセット」としてサブゲノムmRNAを生成するための鋳型として使用される全長のネガティブセンス鎖が生成されます。 集合はゴルジ体への出芽によって起こり、粒子は細胞の表面に輸送されて放出されます。
Ⅲ． いくつかの実施形態の概要
新たに単離されたヒトコロナウイルス（SARS-CoV）が本明細書に開示される。 このウイルスの全ゲノム核酸配列も本明細書に提供される。 SARS-CoV ORFの核酸配列、およびこれらのORFによってコードされるポリペプチド配列も開示される。 １つ以上のＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス核酸、これらのウイルス核酸によってコードされるポリペプチド、およびＳＡＲＳ−ＣｏＶポリペプチドまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶポリペプチド断片に結合する抗体を含む医薬組成物および免疫刺激組成物も開示される。
一実施形態では、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶの存在を検出するための方法が提供される。 この方法は、SARS-CoV核酸にハイブリダイズする一対の核酸プライマーとサンプルを接触させることを含み、少なくとも1つのプライマーはレポーター色素で5'末端標識されており、SARS-CoV核酸またはその断片を増幅する。核酸プライマー対を利用してサンプルから増幅し、増幅産物を電気泳動し、5'末端標識レポーター色素を検出することにより、SARS-CoVを検出する。 特定の非限定的な例では、増幅はRT-PCRを利用する。 提供される方法のさらなる具体例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ核酸にハイブリダイズする核酸プライマーの少なくとも１つは、配列番号１３～１５のいずれか１つに記載の配列を含む。
提供される方法の別の例では、サンプル中のSARS-CoVの存在を検出することは、SARS-CoV核酸にハイブリダイズする一対の核酸プライマーとサンプルを接触させること、SARS-CoV核酸またはその断片を増幅することを含む。一対の核酸プライマーを利用して試料から採取し、増幅されたSARS-CoV核酸またはその断片に、SARS-CoV核酸にハイブリダイズするTaqMan SARS-CoVプローブを付加し、TaqMan SARS-CoVプローブは、 5'-レポーター色素および3'-クエンチャー色素を使用し、1回以上の追加ラウンドの増幅を実行し、5'-レポーター色素の蛍光を検出することにより、SARS-CoVを検出する。 特定の非限定的な例では、増幅はRT-PCRを利用する。 提供される方法のさらに具体的な例では、SARS-CoV核酸にハイブリダイズする核酸プライマーおよび/またはSARS-CoV核酸にハイブリダイズするTaqMan SARS-CoVプローブの少なくとも1つは、設定された配列を含む。配列番号１６〜３３のいずれか１つにおける第４の配列。
別の実施形態では、抗体を含む生体サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶを検出するための方法が提供される。 この方法は、生体サンプルをSARS-CoV特異的抗原と接触させることを含み、抗原にはSARS-CoV生物が含まれ、SARS-CoV特異抗原と生体サンプル中の抗体との間で結合反応が起こるかどうかを判定する（結合反応がある場合）。存在することにより、SARS-CoV を検出します。
さらなる実施形態では、ポリペプチドおよび／またはその断片を含む生体サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶを検出するための方法が提供される。 この方法には、生体サンプルをSARS-CoV特異的抗体と接触させること、およびSARS-CoV特異的抗体と生体サンプル中にSARS-CoVポリペプチドまたはそのフラグメントとの間で結合反応が起こるかどうかを判定し（存在する場合）、それによって検出することが含まれる。 SARS-CoV。 特定の非限定的な例において、SARS-CoV特異的抗体とSARS-CoVポリペプチドまたはそのフラグメントとの間で結合反応が起こるかどうかの決定は、in situまたは組織サンプル中で行われる。 さらなる具体例において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ特異的抗体とＳＡＲＳ－ＣｏＶポリペプチドまたはその断片との間で結合反応が起こるかどうかを決定することには、免疫組織化学的アッセイが含まれる。
さらなる実施形態は、ストリンジェントな条件下でＳＡＲＳ－ＣｏＶ核酸にハイブリダイズする一対の核酸プライマーを含む、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶを検出するためのキットを含み、一方のプライマーはレポーター色素で５’末端標識されている。 特定の非限定的な例では、SARS-CoV核酸にハイブリダイズする核酸プライマーの少なくとも1つは、配列番号13〜15のいずれか1つに記載の配列を含む。
提供されるキットの別の例は、高ストリンジェンシー条件下でSARS-CoV核酸にハイブリダイズする一対の核酸プライマーと、SARS-CoV核酸にハイブリダイズするTaqMan SARS-CoVプローブとを含み、TaqMan SARS-CoVプローブ5'-レポーター色素と 3'-クエンチャー色素で標識されています。 特定の非限定的な例では、SARS-CoV核酸にハイブリダイズする核酸プライマーおよび/またはSARS-CoV核酸にハイブリダイズするTaqMan SARS-CoVプローブの少なくとも1つは、以下に記載の配列を含む。配列番号１６〜３３のいずれかにある。
また、単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ生物を含む組成物も本明細書に開示される。 一実施形態では、単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ生物は、不活性な単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ生物である。 別の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバント、およびそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む。 さらに別の実施形態では、組成物は対象に導入され、それによって対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ抗原エピトープに対する免疫応答を誘発する。
IV. SARS-CoV のヌクレオチドおよびアミノ酸配列
本開示は、単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶゲノム、単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶポリペプチド、およびそれらをコードする単離された核酸分子を提供する。 一実施形態では、単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶゲノムは、配列番号１に示される配列またはその等価物を有する。 SARS-CoVポリペプチド(ゲノム内のORFによってコードされる)をコードするポリヌクレオチドも提供され、SARS-CoV核酸分子と呼ばれる。 これらの核酸分子には、SARS-CoVポリペプチドをコードするDNA、cDNA、およびRNA配列が含まれる。 ORFをコードするSARS-CoV核酸分子の具体的で非限定的な例は、配列番号1の核酸265〜核酸13,398(SARS-CoV 1a、配列番号2をコードする)、核酸13,398〜21,482である。配列番号１の核酸２１，４９２〜２５，２５６（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ １ｂをコードする、配列番号３）、配列番号１の核酸２１，４９２〜２５，２５６（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｓをコードする、配列番号４）、核酸２５，２６８〜２６，０８９配列番号１の核酸２５，６８９〜２６，１５０（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｘ１をコードする、配列番号５）、配列番号１の核酸２５，６８９〜２６，１５０（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｘ２をコードする、配列番号６）、核酸２６，１１７〜２６，３４４配列番号１の核酸２６，３９８〜２７，０６０（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｅをコードする、配列番号７）、配列番号１の核酸２６，３９８〜２７，０６０（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｍをコード、配列番号８）、核酸２７，０７４〜２７，２６２配列番号１の核酸２７，２７３〜２７，６３８（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｘ３をコードする、配列番号９）、配列番号１の核酸２７，２７３〜２７，６３８（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｘ４をコードする、配列番号１０）、核酸２７，８６４〜２８，１１５配列番号１の核酸２８，１２０〜２９，３８５（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｘ５をコードする、配列番号１１）、および配列番号１の核酸２８，１２０〜２９，３８５（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｎ、配列番号１２をコードする）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶゲノム（配列番号１）に由来するオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブも、本開示の範囲内に包含される。 このようなオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、SARS-CoV核酸配列の少なくとも約15個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも約20、25、30、35、40、45、または50個以上の連続したヌクレオチドの配列を含み得る。 これらのプライマーおよびプローブは、特に本明細書に開示されるORFのいずれかからなど、開示されるSARS-CoVゲノム(配列番号1)の任意の領域から得ることができる。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶゲノム（配列番号１）に由来するオリゴヌクレオチドプライマーの具体的な非限定的な例としては、Ｃｏｒ－ｐ－Ｆ２（配列番号１３）、Ｃｏｒ－ｐ－Ｆ３（配列番号１４）が挙げられる。 、Ｃｏｒ−ｐ−Ｒ１（配列番号１５）、ＳＡＲＳ１−Ｆ（配列番号１６）、ＳＡＲＳ１−Ｒ（配列番号１７）、ＳＡＲＳ２−Ｆ（配列番号１９）、ＳＡＲＳ２−Ｒ （配列番号２０）、ＳＡＲＳ３−Ｆ（配列番号２２）、ＳＡＲＳ３−Ｒ（配列番号２３）、Ｎ３−Ｆ（配列番号２５）、Ｎ３−Ｒ（配列番号２６） ）、３’ＮＴＲ−Ｆ（配列番号２８）、３’ＮＴＲ−Ｒ（配列番号２９）、ＭＦ（配列番号３１）、およびＭＲ（配列番号３２）。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶゲノム（配列番号１）に由来するオリゴヌクレオチドプローブの具体的で非限定的な例としては、ＳＡＲＳ１－Ｐ（配列番号１８）、ＳＡＲＳ２－Ｐ（配列番号２１）、ＳＡＲＳ３－Ｐが挙げられる。 （配列番号２４）、Ｎ３−Ｐ（配列番号２７）、３'ＮＴＲ−Ｐ（配列番号３０）、およびＭＰ（配列番号３３）。
SARS-CoVポリペプチドをコードする核酸分子は、調節配列または調節エレメントに作動可能に連結され得る。 調節配列または調節エレメントには、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（例えばATG）、終止コドンなどが含まれるが、これらに限定されない。
さらに、SARS-CoVポリペプチドをコードする核酸分子を発現ベクターに挿入することができる。 ベクターの具体的で非限定的な例には、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、動物ウイルスおよび酵母人工染色体（YAC）が含まれる（Burke et al., Science 236:806-12, 1987）。 次いで、このようなベクターは、体細胞、および細菌、真菌（Timberlake and Marshall、 Science 244:1313-17、1989）、無脊椎動物、植物（Gasser et al.、 Plant Cell 1:15–24, 1989)、および動物 (Pursel et al., Science 244:1281–88, 1989)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶポリペプチドをコードする核酸分子を担持する発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知である従来の技術によって行うことができる。 例として、宿主が大腸菌などの原核生物である場合、 DNA 取り込みが可能なコンピテント細胞は、対数増殖期後に採取された細胞から調製され、その後、当技術分野で CaCl 2 周知の手順を使用して 法によって処理され得る。 。 あるいは、MgCl 2 または RbCl を使用することもできます。 形質転換は、必要に応じて宿主細胞のプロトプラストを形成した後、またはエレクトロポレーションによって行うこともできる。
宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈殿などのDNAのトランスフェクション方法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの従来の機械的手順、リポソームに包まれたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターを使用することができる。 真核細胞は、SARS-CoV 核酸分子と、単純ヘルペス チミジンキナーゼ遺伝子などの選択可能な表現型をコードする 2 番目の外来 DNA 分子で共形質転換することもできます。 別の方法は、シミアンウイルス４０またはウシパピローマウイルスなどの真核ウイルスベクターを使用して、真核細胞を一時的に感染または形質転換し、タンパク質を発現させることである（例えば、「真核 ウイルスベクター」 、コールドスプリングハーバー研究所、グルズマン編、 1982年）。
本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶポリペプチドには、本明細書に開示されるＯＲＦのいずれかによってコードされるタンパク質、およびその等価物が含まれる。 SARS-CoVタンパク質の特定の非限定的な例は、配列番号2〜12に提供される。 SARS-CoVポリペプチドに化学的に結合した異種アミノ酸配列を含む融合タンパク質も企図される。 例示的な異種配列には、短いアミノ酸配列タグ(6つのヒスチジン残基など)、および他のタンパク質の融合体(c-mycまたは緑色蛍光タンパク質融合体など)が含まれる。 抗体によって認識されるか、または主要組織適合性複合体に結合し、SARS-CoV特異的免疫応答を誘導するために使用できるSARS-CoVタンパク質のエピトープも本開示に包含される。
に導入したクローン化遺伝子から大量のタンパク質を発現させる方法は、 大腸菌 タンパク質の精製や機能解析に利用できる可能性があります。 例えば、 SARS-CoVタンパク質に連結された大腸菌 lacZ遺伝子またはtrpE遺伝子の一部によってコードされるアミノ末端ペプチドからなる融合タンパク質は、これらのタンパク質に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製するために使用され得る。
生産される場合もあります インタクトな天然タンパク質は、機能研究のために大腸菌 内で大量に 。 細菌内で融合タンパク質および無傷の天然タンパク質を生成するための方法およびプラスミドベクターは、Sambrook et al. によって記載されている。 (編)、 分子クローニング: 実験マニュアル、 2 nd 編、vol. このような融合タンパク質は大量に作製でき、精製が容易で、抗体応答を誘発するために使用できます。 天然タンパク質は、クローン化された遺伝子の上流に強力で制御されたプロモーターと効率的なリボソーム結合部位を配置することによって細菌内で生成できます。 生成されるタンパク質のレベルが低い場合は、タンパク質の生成を増やすために追加の措置を講じることがあります。 高レベルのタンパク質が生成される場合、精製は比較的簡単です。 適切な方法は、Sambrook et al. によって提示されています。 (編)、分子クローニング: 実験マニュアル、2 nd 編、vol. １〜３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９に記載されており、当技術分野でよく知られている。 多くの場合、高レベルで発現されたタンパク質は不溶性封入体で見つかります。 これらの凝集体からタンパク質を抽出する方法は、Sambrook et al. によって説明されています。 (編)、 分子クローニング: 実験マニュアル、 2 nd 編、vol. 1–3、コールド スプリング ハーバー研究所出版局、コールド スプリング ハーバー、ニューヨーク州、1989 年。
組換え発現されたタンパク質の単離および精製は、分取クロマトグラフィーおよび免疫学的分離を含む従来の手段によって実行され得る。 さらに、タンパク質は、当技術分野で知られている多くの手動または自動合成方法のいずれかによって化学的に合成することができる。
V. 特異的結合剤
本開示は、本明細書に開示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶポリペプチドに結合する特異的結合剤を提供する。 この結合剤は、ポリペプチドの精製および検出、ならびにSARS-CoVの検出および診断に有用である可能性がある。 結合剤の例は、本明細書に開示されるSARS-CoVポリペプチドのいずれかと結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、およびその断片である。
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、本明細書に記載のSARS-CoVポリペプチド、またはその断片もしくは変異体を認識するために産生され得る。 最適には、これらのポリペプチドに対して産生された抗体は、抗体が生成されたポリペプチドを特異的に検出するであろう。 すなわち、特定のSARS-CoVポリペプチドに対して産生された抗体は、そのポリペプチドを認識して結合するが、他のポリペプチドまたは抗原を実質的に認識または結合しない。 抗体が標的ポリペプチドに特異的に結合するかどうかの決定は、多数の標準的なイムノアッセイ法のいずれかによって行われます。 たとえば、ウェスタンブロッティング技術 (Sambrook et al. (ed.)、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual、 2 nd 編、vol. 1–3、コールド スプリング ハーバー研究所出版局、コールド スプリング ハーバー、ニューヨーク州、1989）。
免疫原としての使用に適した実質的に純粋なＳＡＲＳ－ＣｏＶ組換えポリペプチド抗原は、当技術分野で周知の方法を使用して、上記の形質転換細胞から単離され得る。 次いで、抗原に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を調製することができる。
ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、Kohler & Milsteinの古典的な方法( Nature 256:495-97, 1975)、またはその派生方法に従ってマウスハイブリドーマから調製することができる。 簡単に言うと、マウスに数マイクログラムの選択されたタンパク質免疫原（例えば、少なくとも1つのSARS-CoV特異的エピトープを含むポリペプチド、少なくとも1つのSARS-CoV特異的エピトープを含むポリペプチドの一部、または少なくとも1つのSARS-CoV特異的エピトープを含む合成ペプチド）を数週間かけて行う。 次にマウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離します。 脾臓細胞は、ポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫細胞と融合され、過剰な未融合細胞は、アミノプテリンを含む選択培地（HAT培地）上での系の増殖により破壊される。 融合に成功した細胞を希釈し、その希釈液のアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに置き、そこで培養の増殖を継続する。 抗体産生クローンは、Engvall ( メス。 Enzymol.、 70:419-39、1980)、またはその派生方法。 選択された陽性クローンを拡張し、そのモノクローナル抗体産物を収集して使用できます。 モノクローナル抗体産生の詳細な手順は、Harlow and Lane著「 Using Antibodies: A Laboratory Manual」 、CSHL、ニューヨーク、1999年に記載されている。
抗体を含むポリクローナル抗血清は、少なくとも1つのSARS-CoV特異的エピトープを含むポリペプチド、少なくとも1つのSARS-CoV特異的エピトープを含むポリペプチドの一部、または少なくとも1つのSARSを含む合成ペプチドで適切な動物を免疫化することによって調製することができる。 -CoV 特異的エピトープ。未修飾または免疫原性を高めるために修飾することができます。
効果的な抗体産生（モノクローナルまたはポリクローナル）は、抗原と宿主種の両方に関連する多くの要因の影響を受けます。 たとえば、小分子は他の分子よりも免疫原性が低い傾向があり、担体やアジュバントの使用が必要になる場合があります。 また、宿主動物は接種部位や用量に応じて変化し、抗原の用量が不十分または過剰になると抗血清の力価が低くなります。 複数の皮内部位に投与される抗原の少量 (ng レベル) が最も信頼性が高いと思われます。 ウサギの効果的な免疫化プロトコルは、Vaitukaitis et al. に記載されています。 ( J. Clin. Endocrinol. Metab.、 33:988–91、1971)。
追加免疫注射は一定の間隔で投与することができ、例えば既知濃度の抗原に対する寒天中での二重免疫拡散によって半定量的に決定される抗体力価が低下し始めたときに抗血清を採取する。 例えば、Ouchterlony et al., Handbook of Experimental Immunology , Wier, D. (ed.), Chapter 19, Blackwell, 1973を参照。抗体のプラトー濃度は通常、血清1ml当たり0.1～0.2mgの範囲である。 (約12μM)。 抗原に対する抗血清の親和性は、例えばＦｉｓｈｅｒ（ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 、第４２章、１９８０）によって記載されているように、競合結合曲線を作成することによって決定される。
抗体断片は抗体全体の代わりに使用でき、原核宿主細胞で容易に発現できます。 「抗体フラグメント」とも呼ばれる、モノクローナル抗体の免疫学的に有効な部分を作製および使用する方法は周知であり、Ｂｅｔｔｅｒ＆Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． 178:476–96、1989; Glockshuber et al.、 Biochemistry 29:1362–67、1990; および米国特許第５，０００，０００号。 米国特許第5,648,237号（機能的抗体断片の発現）； 米国特許第 米国特許第４，９４６，７７８号（単一ポリペプチド鎖結合分子）； および米国特許第５，０００，０００号。 米国特許第５，４５５，０３０号（単鎖ポリペプチド結合分子を使用する免疫療法）、およびそこに引用されている参考文献。 ポリペプチド／結合剤複合体が形成できる条件、ならびにポリペプチド／結合剤複合体の形成の検出および結合剤とポリペプチドの結合親和性の定量のためのアッセイは、当技術分野で標準である。 このようなアッセイには、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫蛍光、免疫細胞化学、免疫組織化学、蛍光活性化セルソーティング（FACS）、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）、免疫磁気アッセイ、ELISA、ELISPOT（Coligan et al.、 当業者にはよく知られているように、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 、Ｗｉｌｅｙ、ＮＹ、１９９５）、凝集アッセイ、凝集アッセイ、細胞パニング等が挙げられる。
本開示の結合剤は、基質（例えば、ビーズ、チューブ、スライド、プレート、ニトロセルロースシートなど）に結合するか、検出可能な部分と結合するか、あるいは結合および結合の両方が可能である。 本開示のために企図される検出可能部分には、免疫蛍光部分（例えば、フルオレセイン、ローダミン）、放射性部分（例えば、 32 P、 125 私、 35 Ｓ）、酵素部分（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、金コロイド部分、およびビオチン部分。 このようなコンジュゲーション技術は当該技術分野において標準である（例えば、Harlow and Lane、 Using Antibodies: A Laboratory Manual 、CSHL、ニューヨーク、1999；Yang et al.、 Nature、 382:319-24、1996を参照）。
VI. SARS-CoV の検出と診断
A. 核酸に基づく検出および診断方法
ここで提示される SARS-CoV 配列情報の主な用途は、SARS-CoV 感染の検出および診断検査の分野です。 対象がSARS-CoVに感染しているか、または現在感染しているかを決定するために対象をスクリーニングする方法が本明細書に開示される。
このような方法の１つは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸を含むサンプルを提供すること、およびサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ核酸分子の存在を検出するためのアッセイを提供することを含む。 適切なサンプルには、細胞、組織（例えば、肺および腎臓）、体液（例えば、血液、血清、尿、唾液、痰、脳脊髄液）、骨髄穿刺液、BAL、および口腔咽頭洗浄。 追加の適切なサンプルには、屋内または屋外環境内の無生物または貯蔵所から得られるサンプルを含むがこれらに限定されない、環境中のウイルスの存在の検出に有用なすべての環境サンプルが含まれる。 サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ核酸分子の検出は、多くの方法論によって行うことができ、その非限定的な例を以下に概説する。
一実施形態では、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ核酸分子の存在の検出には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ核酸配列（またはその断片）の増幅が含まれる。 任意の核酸増幅方法を使用することができる。 １つの特定の非限定的な例において、ＰＣＲは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ核酸配列を増幅するために使用される。 別の非限定的な例では、RT-PCRを使用してSARS-CoV核酸配列を増幅することができる。 さらなる非限定的な例では、転写媒介増幅を使用して、SARS-CoV核酸配列を増幅することができる。
いくつかの実施形態では、一対のＳＡＲＳ－ＣｏＶ特異的プライマーが増幅反応に利用される。 プライマーの一方または両方を末端標識することができます（たとえば、放射性標識、フルオレセイン化、またはビオチン化）。 １つの特定の非限定的な例では、プライマーの少なくとも１つは、レポーター色素６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）で５'末端標識される。 このプライマー対には、上流プライマー（下流プライマーの５'に結合する）および下流プライマー（上流プライマーの３'に結合する）が含まれる。 一実施形態では、上流プライマーまたは下流プライマーのいずれかが標識される。 SARS-CoV特異的プライマーの具体的な非限定的な例としては、Cor-p-F2(配列番号13)、Cor-p-F3(配列番号14)、Cor-pが挙げられるが、これらに限定されない。 -R1 (配列番号: 15)、SARS1-F (配列番号: 16)、SARS1-R (配列番号: 17)、SARS2-F (配列番号: 19)、SARS2-R (配列番号: 19) ：２０）、ＳＡＲＳ３−Ｆ（配列番号２２）、ＳＡＲＳ３−Ｒ（配列番号２３）、Ｎ３−Ｆ（配列番号２５）、Ｎ３−Ｒ（配列番号２６）、３' ＮＴＲ−Ｆ（配列番号２８）、３'ＮＴＲ−Ｒ（配列番号２９）、ＭＦ（配列番号３１）、およびＭＲ（配列番号３２）。 追加のプライマー対は、例えば、周知のプライマー設計原理および方法を使用して、本明細書に記載される特定のORFのいずれかを増幅するために生成され得る。
１つの特定の非限定的な例では、増幅されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ特異的配列を検出するために電気泳動が使用される。 電気泳動は、当技術分野でよく知られている多くの方法を使用して自動化することができる。 一実施形態では、ＡＢＩ ３１００ Ｐｒｉｓｍ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）などの遺伝子分析装置が使用され、バンドはＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェア（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して分析される。
別の特定の非限定的な例では、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して、区別できるオリゴヌクレオチドプローブを使用して増幅されたSARS-CoV特異的配列を検出する。 このようなプローブには、「TaqMan」プローブが含まれる。 TaqMan プローブは、5' 末端にレポーター、3' 末端にクエンチャーを備えたオリゴヌクレオチドで構成されています。 １つの特定の非限定的な例では、レポーターは６－ＦＡＭであり、クエンチャーはブラックホールクエンチャー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）である。 プローブが無傷である場合、レポーターがクエンチャーに近接すると、主に蛍光共鳴エネルギー移動によってレポーターの蛍光が抑制されます。 目的のターゲットが存在する場合、TaqMan プローブは、PCR アニーリング ステップ中にフォワード プライマー サイトとリバース プライマー サイトの間で特異的にハイブリダイズします。 PCR 伸長のプロセスでは、Taq DNA ポリメラーゼの 5'-3' ヌクレオチド分解活性により、レポーターとクエンチャーの間でハイブリダイズしたプローブが切断されます。 その後、プローブフラグメントがターゲットから移動され、鎖の重合が継続します。 Taq DNA ポリメラーゼは、ハイブリダイズしていないプローブを切断せず、重合中にのみハイブリダイズしたプローブを切断します。 プローブの 3' 末端は、PCR 中のプローブの伸長を防ぐためにブロックされています。 ハイブリダイズしたプローブの 5'-3' ヌクレアーゼによる切断はサイクルごとに発生し、PCR 産物の指数関数的な蓄積を妨げません。 PCR産物の蓄積は、放出されたレポーターの蛍光の増加をモニタリングすることによって直接検出されます。 蛍光シグナルの増加は、ターゲット配列がプローブに相補的であり、PCR 中に増幅される場合にのみ検出されます。 したがって、非特異的な増幅は検出されません。 本開示のＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的ＴａｑＭａｎプローブとしては、ＳＡＲＳ１−Ｐ（配列番号１８）、ＳＡＲＳ２−Ｐ（配列番号２１）、ＳＡＲＳ３−Ｐ（配列番号２４）が挙げられるが、これらに限定されない。 ）、N3-P（配列番号27）、3'NTR-P（配列番号30）、およびMP（配列番号33）、およびハイブリダイゼーションアッセイには、これらに限定されないが、実際のアッセイが含まれる。 RT-PCR アッセイの時間。
B. タンパク質に基づく検出および診断方法
本開示はさらに、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ抗原を検出する方法、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ抗原を検出することによって対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染を診断する方法を提供する。 このような方法の例には、抗原/結合剤複合体が形成できる条件下でサンプルをSARS-CoV特異的結合剤と接触させることが含まれる。 複合体の形成を検出し、それによってサンプル中のSARS-CoV抗原を検出し、および/または対象におけるSARS-CoV感染を診断する。 少なくとも特定の抗原は、無傷のSARS-CoVビリオン上に存在するか、抗原を発現するSARS-CoV感染細胞の表面に表示されるSARS-CoVコード化タンパク質であるか、またはその断片であることが企図される。抗原。 これらの方法による分析の対象となる想定されるサンプルは、対象におけるウイルス感染の検出に有用な臨床サンプルなどの任意のサンプルを含むことができる。
サンプル中の抗原を検出する方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． 分子生物学の短いプロトコル、 4 番目 ＩＦＡ、ＥＬＩＳＡおよびイムノブロッティングなどの酵素免疫測定法は、本開示の方法に従ってＳＡＲＳ－ＣｏＶ抗原の検出を達成するために容易に適合させることができる。 可溶性 SARS-CoV 抗原の検出に有効な ELISA 法は、直接競合 ELISA です。 この方法は、特定の SARS-CoV 抗体と精製された SARS-CoV 抗原が利用可能な場合に最も役立ちます。 簡単に言うと: 1) SARS-CoV 抗原を含む疑いのあるサンプルで基板 (たとえば、マイクロタイター プレート) をコーティングします。 ２）結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ抗原を、検出可能な部分（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼ酵素）に結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ特異的抗体と接触させる。 3) 精製した阻害剤 SARS-CoV 抗原を追加します。 ４）上記のものを酵素の基質と接触させる。 ５）色の変化または蛍光の阻害を観察／測定し、抗原濃度を定量する（例えば、マイクロタイタープレートリーダーを使用する）。
可溶性 SARS-CoV 抗原の検出に有効な追加の ELISA 方法は、抗体サンドイッチ ELISA です。 この方法は、多くの場合、直接競合 ELISA 法よりも抗原の検出感度が高くなります。 簡単に言うと: 1) 基板 (たとえば、マイクロタイター プレート) を SARS-CoV 特異的抗体でコーティングします。 2) 結合した SARS-CoV 抗体を、SARS-CoV 抗原を含む疑いのあるサンプルと接触させる。 ３）上記を、検出可能な部分（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼ酵素）に結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ特異的抗体と接触させる。 ４）上記のものを酵素の基質と接触させる。 ５）色の変化または蛍光を観察／測定し、抗原濃度を定量する（例えば、マイクロタイタープレートリーダーを使用する）。
細胞表面 SARS-CoV 抗原の検出に有効な ELISA 法は、直接細胞 ELISA です。 簡単に説明すると、細胞表面 SARS-CoV 抗原を示すと疑われる細胞を固定し（たとえば、グルタルアルデヒドを使用）、検出可能な部分（たとえば、ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ酵素またはアルカリ ホスファターゼ酵素）に結合した SARS-CoV 特異的抗体とともにインキュベートします。 。 洗浄して未結合の抗体を除去した後、酵素の基質を添加し、色の変化または蛍光を観察/測定します。
本開示はさらに、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ反応性抗体を検出する方法、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ反応性抗体を検出することによって対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染を診断する方法を提供する。 このような方法の例は、ポリペプチド/抗体複合体が形成できる条件下でサンプルを本開示のSARS-CoVポリペプチドと接触させることを含む。 複合体の形成を検出し、それによってサンプル中のSARS-CoV抗体を検出し、および/または対象におけるSARS-CoV感染を診断する。 これらの方法による分析の対象となる想定されるサンプルは、対象におけるウイルス感染の検出に有用であるとして本明細書に記載される臨床サンプルなどの任意のサンプルを含むことができる。
サンプル中の抗体を検出する方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． 分子生物学の短いプロトコル、 4 番目 ＩＦＡ、ＥＬＩＳＡおよびイムノブロッティングなどの酵素イムノアッセイは、本開示の方法に従ってＳＡＲＳ－ＣｏＶ抗体の検出を達成するために容易に適合させることができる。 特定の SARS-CoV 抗体の検出に有効な ELISA 法は、間接 ELISA 法です。 簡単に説明すると、1) SARS-CoVポリペプチドを基板(例えば、マイクロタイタープレート)に結合させる; 2) 結合したポリペプチドをSARS-CoV抗体を含む疑いのあるサンプルと接触させる; ３）上記のものを、結合した抗体と反応する検出可能な部分に結合した二次抗体（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼ酵素）と接触させる。 ４）上記のものを酵素の基質と接触させる。 ５）色の変化または蛍光を観察／測定する。
SARS-CoV抗体の検出に有用な別の免疫学的技術は、競合阻害アッセイにおいてSARS-CoVポリペプチドと特異的に反応する抗体の検出にモノクローナル抗体を使用する。 簡単に言うと、SARS-CoV抗体を含むと疑われるサンプルを、基板(例えば、マイクロタイタープレート)に結合した本開示のSARS-CoVポリペプチドと接触させる。 余分なサンプルは完全に洗い流されます。 次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶポリペプチドに特異的な標識された（例えば、酵素結合、蛍光、放射性など）モノクローナル抗体を、以前に形成されたポリペプチド－抗体複合体と接触させ、モノクローナル抗体の結合量が測定される。 モノクローナル抗体結合の阻害量を対照（モノクローナル抗体なし）と比較して測定することで、サンプル中の抗体の検出および測定が可能になります。 モノクローナル抗体阻害の程度は、SARS-CoV を検出するための非常に特異的なアッセイとなりえます。 モノクローナル抗体は、例えば標準的な方法によるIFA分析による、細胞または組織サンプル中のSARS-CoVの直接検出にも使用できます。
さらなる例として、微小凝集試験を使用して、サンプル中の SARS-CoV 抗体の存在を検出できます。 簡単に言うと、ラテックスビーズ、赤血球、または他の凝集性粒子は、本開示のＳＡＲＳ−ＣｏＶポリペプチドでコーティングされ、サンプルと混合され、その結果、抗原と特異的に反応するサンプル中の抗体が抗原と架橋して凝集を引き起こす。 凝集したポリペプチド-抗体複合体は、肉眼で見えるか、分光光度計で測定できる沈殿を形成します。 上記試験の改変において、本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ特異的抗体は凝集性粒子に結合することができ、それによりサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ抗原が検出される。
VII. 医薬組成物および免疫刺激組成物およびその使用
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ核酸配列、ＳＡＲＳ－ＣｏＶポリペプチド、またはこれらのポリペプチドに結合する抗体を含む医薬組成物も本開示に包含される。 これらの医薬組成物は、治療有効量の1つまたは複数のSARS-CoVポリペプチド、SARS-CoVポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸分子、またはSARS-CoVポリペプチドに結合する抗体を、薬学的に許容される担体とともに含む。
本明細書には、ＳＡＲＳの阻害または治療のための免疫刺激組成物としての使用に適した物質が開示される。 特定の免疫刺激組成物は、SARS-CoVに対して向けられており、SARS-CoVから得られる抗原が含まれる。 一実施形態では、免疫刺激組成物は弱毒化ＳＡＲＳ－ＣｏＶを含む。 ウイルスの弱毒化の方法は当技術分野で周知であり、これらに限定されないが、長期連続継代（例えば、弱毒化されたビリオンを選択するための特定の環境条件下で感受性の宿主細胞において）、変異原性物質への曝露（例えば、 、化学的突然変異原または放射線）、組換えDNA技術を使用した遺伝子工学（たとえば、1つまたは複数のウイルス遺伝子を無効にする遺伝子置換または遺伝子ノックアウトの使用）、またはそれらの組み合わせ。
別の実施形態では、免疫刺激組成物は、不活化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶを含む。 ウイルス不活化の方法は当技術分野で周知であり、熱および化学物質（例えば、ホルマリン、β-プロピオラクトン、およびエチレンイミン）が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに別の実施形態では、免疫刺激組成物は、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ核酸分子を含む核酸ベクター、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶの免疫原性ポリペプチドもしくはポリペプチド断片をコードする核酸配列、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ由来の核酸配列を含む核酸ベクターを含み、 SARS-CoVの表面タンパク質をコードするポリペプチドなど。
さらなる実施形態では、免疫刺激組成物は、糖タンパク質、主要キャプシドタンパク質、または体液性および／または細胞性免疫応答を誘発することが判明している他の遺伝子産物などのＳＡＲＳ－ＣｏＶサブユニットを含む。
提供される免疫刺激性SARS-CoVポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする構築物またはベクターは、免疫刺激性組成物としてヒトまたは動物対象に投与するために、薬学的に許容される担体またはビヒクルと組み合わされる。 いくつかの実施形態では、２つ以上の免疫刺激性ＳＡＲＳ－ＣｏＶポリペプチドを組み合わせて、単一の調製物を形成することができる。
免疫原性製剤は、単位剤形で都合よく提供され、従来の製薬技術を使用して調製され得る。 このような技術には、活性成分と薬学的担体または賦形剤とを結合させるステップが含まれる。 一般に、製剤は、活性成分を液体担体と均一かつ緊密に結合させることによって調製される。 非経口投与に適した製剤には、製剤を対象者の血液と等張にする抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および溶質を含む水性および非水性の滅菌注射液が含まれる。 懸濁剤および増粘剤を含む水性および非水性の滅菌懸濁液。 製剤は、単位用量または複数回用量の容器、たとえば密封されたアンプルやバイアルで提供され、滅菌液体担体、たとえば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存できます。注射の場合は使用直前に。 即時の注射溶液および懸濁液は、当業者によって一般的に使用される滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
特定の実施形態では、単位用量製剤は、投与される成分の用量もしくは単位、またはその適切な部分を含む製剤である。 特に上述した成分に加えて、本明細書に包含される製剤は、当業者によって一般的に使用される他の薬剤を含み得ることを理解されたい。
免疫刺激組成物として使用するための組成物を含む、本明細書に提供される組成物は、口腔および舌下を含む経口、直腸、非経口、エアロゾル、鼻、筋肉内、皮下、皮内、および局所などの異なる経路を通じて投与することができる。 それらは、溶液、乳濁液および懸濁液、マイクロスフェア、粒子、微粒子、ナノ粒子、およびリポソームを含むがこれらに限定されない、異なる形態で投与され得る。
投与量は投与経路によって異なります。 一例として、筋肉内注射は、約０．１ｍｌから約１．０ｍｌの範囲であり得る。 当業者であれば、異なる投与経路に対する適切な量を知るであろう。
免疫刺激化合物 (ワクチンなど) の分野における比較的最近の開発は、ペプチド抗原をコードする核酸分子の直接注射です (Janeway & Travers、 Immunobiology: The Immune System In Health and Disaster 、13.25 ページ、Garland に広く記載されています) Publishing, Inc.、ニューヨーク、1997 年;および McDonnell & Askari、 N. Engl. J. Med. 334:42–45、1996)。 本明細書に記載の核酸分子を含むベクター、または免疫原性SARS-CoVポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターは、そのようなDNAワクチン接種法に利用され得る。
したがって、本明細書で使用される用語「免疫刺激組成物」には、SARS-CoVポリペプチドをコードする核酸分子が医薬組成物として対象に投与される核酸ワクチンも含まれる。 遺伝子免疫化の場合、当業者に公知の適切な送達方法には、筋肉へのプラスミドDNAの直接注射(Wolffら、 Hum.Mol.Genet.1 :363、1992)、特定のタンパク質担体と複合体を形成したDNAの送達(1992)が含まれる。 Wu et al., J. Biol. Chem. 264:16985, 1989)、DNA とリン酸カルシウムの共沈殿 (Benvenisty and Reshef, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:9551, 1986)、DNA のカプセル化リポソーム（Kaneda et al., Science 243:375, 1989）、粒子衝撃（Tang et al., Nature 356:152, 1992;Eisenbraun et al., DNA Cell Biol. 12:791, 1993）、およびインビボ感染クローン化されたレトロウイルスベクターを使用する（Seeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:5849, 1984）。 同様に、核酸ワクチン調製物は、ウイルス担体を介して投与することができる。
免疫刺激組成物の各用量における免疫刺激化合物の量は、重大な有害な副作用を伴わずに免疫刺激または免疫防御反応を誘導する量として選択される。 そのような量は、どの特定の免疫原が使用されるか、およびそれがどのように提示されるかに応じて変化する。 初回注射は約１μｇ〜約１ｍｇの範囲であり得、いくつかの実施形態は約１０μｇ〜約８００μｇの範囲を有し、さらに他の実施形態は約２５μｇ〜約５００μｇの範囲を有する。 免疫刺激組成物の初回投与に続いて、対象は、十分な間隔を置いて１回または数回の追加免疫投与を受けてもよい。 追加免疫投与は、約１μｇから約１ｍｇの範囲であってもよく、他の実施形態では約１０μｇから約７５０μｇの範囲であり、さらに他の実施形態では約５０μｇから約５００μｇの範囲である。 望ましいレベルの防御免疫を維持するには、1 ～ 5 年、たとえば 3 年の間隔で定期的に追加免疫を行うことが望ましい場合があります。
提供される免疫刺激分子および組成物は、まずインビトロで細胞を刺激し、その後、刺激された細胞を対象に投与して免疫応答を誘発することによって、間接的に対象に投与できることも企図される。 さらに、医薬組成物または免疫刺激組成物または治療方法は、他の治療処置と組み合わせて投与することができる。
Ⅷ. キット
また、本明細書では、SARS-CoVの検出および/または診断に有用なキットも提供される。 これには、本明細書に開示されるような核酸およびタンパク質の検出方法で使用するためのキットが含まれる。
本明細書に記載のSARS-CoV特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、SARS-CoVの検出に使用するためのキットの形態で供給することができる。 このようなキットでは、適切な量の１つまたは複数のオリゴヌクレオチドが１つまたは複数の容器に提供されるか、または基板上に保持される。 オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、例えば、水溶液中で、または凍結乾燥もしくは凍結乾燥粉末として提供され得る。 オリゴヌクレオチドが供給される容器は、供給される形態を保持できる任意の従来の容器、例えば、微量遠心分離管、アンプル、またはボトルであり得る。 一部の用途では、プライマーのペアが、事前に測定された 1 回使用量で個別の (通常は使い捨ての) チューブまたは同等の容器に入れて提供されます。 このような配置により、SARS-CoV核酸の存在について検査されるサンプルを個々のチューブに添加し、増幅を直接実行することができる。
キットに含まれる各オリゴヌクレオチドの量は、任意の適切な量にすることができ、製品が対象とする市場によって異なります。 例えば、キットが研究または臨床用途に適合している場合、提供される各オリゴヌクレオチドプライマーの量は、いくつかの PCR 増幅反応を開始するのに十分な量である可能性があります。 適切な量を決定するための一般的なガイドラインは、例えば、Sambrookら、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、2001; に見出すことができる。 オースベルら。 (編)、分子生物学における短いプロトコル、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク州ニューヨーク、1999年。 およびＩｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州、１９９９年。キットには、より多くのＳＡＲＳの増幅を容易にするために、２つ以上のプライマーを含めることができる。 CoV ヌクレオチド配列。
いくつかの実施形態では、キットはまた、ＤＮＡサンプル調製試薬、適切な緩衝液（例えば、ポリメラーゼ緩衝液）、塩（例えば、塩化マグネシウム）、およびデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を含む、インビトロ増幅反応を実施するために必要な１つまたは複数の試薬を含む。 。
キットには、SARS-CoVヌクレオチド配列の検出に使用するための、標識されたまたは標識されていないオリゴヌクレオチドプライマーおよび/またはプローブが含まれ得る。 このようなプローブに適切な配列は、プローブが相補的な配列が増幅反応中に増幅されるように、提供された２つのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング部位の間にある任意の配列である。
増幅反応で使用するための 1 つ以上の制御配列もキットで提供できます。 他の特定の実施形態では、キットは、サンプルからヌクレオチドを抽出および／または精製するための機器、試薬、および説明書を含む。
SARS-CoV抗原を検出するためのキットには、例えば少なくとも1つのSARS-CoV抗原特異的結合剤(例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体または抗体断片)が含まれる。 キットはまた、抗原：特異的結合剤複合体を検出するための手段を含んでもよく、例えば、特異的結合剤は検出可能に標識され得る。 特異的結合剤が標識されていない場合、例えば二次抗体またはプロテイン A によって検出できます。これらは、1 つ以上の別個の容器に入った一部のキットで提供されることもあります。 このような技術はよく知られている。
本明細書で提供されるアッセイキットの別の例は、抗原としての組換えSARS-CoV特異的ポリペプチド(またはその断片)および二次抗体としての酵素結合抗ヒト抗体である。 このようなキットの例には、1つまたは複数の酵素基質も含まれ得る。 このようなキットは、対象からのサンプルにSARS-CoV特異的タンパク質に対する抗体が含まれているかどうかを検査するために使用できます。
本開示の主題は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
実施例 実施
例1
SARS-CoVの分離と特性評価
ウイルスの分離と超微細構造の特徴付け
この例では、SARS 患者からの新しいヒトコロナウイルスの最初の分離と特性評価について説明します。
SARS の症例定義を満たす患者からのさまざまな臨床検体 (血液、血清、口腔咽頭ぬぐい液または洗浄液からの材料、鼻咽頭ぬぐい液からの材料、および解剖で収集された主要臓器の組織) が疾病管理予防センターに送られました。 CDC) SARS の病因調査の一環として。 これらのサンプルを、Vero E6、NCI-H292、MDCK、LLC-MK2、B95-8 細胞を含む多数の連続細胞株に接種し、乳を飲んでいる ICR マウスに頭蓋内および腹腔内経路で接種しました。 すべての培養物を毎日 CPE について観察しました。 維持培地を７日目に補充し、接種後１４日目に培養を終了した。 特定可能な CPE を示した培養物はすべて、影響の原因を特定するためにいくつかの手順を受けました。 乳を飲んでいるマウスを 14 日間毎日観察し、病気のマウスまたは死亡したマウスを濾過して継代培養した脳懸濁液を調製することによってさらにテストしました。 14日後も元気だったマウスは屠殺し、検査結果は陰性として記録された。
患者 16 (複数の SARS 患者がいる病院と疫学的なつながりがある 46 歳の男性医師) の中咽頭検体を接種した 2 つの細胞株、Vero E6 細胞と NCI-H292 細胞は、最初に CPE を示しました (表 1)。
表1 1 つ以上の方法* により SARS-CoV 陽性となった SARS 患者からの検体。 暴露 調査結果 忍耐強い そして 胸に 病院- 血清学的 いいえ。 設定 年齢・性別 レントゲン写真 化 結果 検体 分離 RT-PCR 1 シンガポール、 53歳/女性 肺炎 はい + 鼻、 − まだ完成してない 病院 口腔咽頭 綿棒 2† ホン 36歳/女性 肺炎 はい + 鼻腔、綿棒 − まだ完成してない コング、 ホテル 3 ホン 22歳/月 肺炎 はい + 綿棒 − − コング、 ホテル 4† ホン 39歳/月 肺炎 はい + 鼻、 − − コング、 咽頭 ホテル 綿棒 5 ホン 49歳/月 肺炎 はい まだ完成してない 喀痰 + + コング、 ホテル 6‡ ホン 46歳/月 肺炎 はい + 腎臓、肺、 +§ + コング、 気管支肺胞 ホテル 洗浄 7 ベトナム、 アダルト/ 肺炎 はい − 中咽頭 + + 病院 未知 洗う 8 ベトナム、 アダルト/ 肺炎 はい − 中咽頭 − + 病院 未知 洗う 9 ベトナム、 アダルト/ 肺炎 はい − 中咽頭 − + 病院 未知 洗う 10 ベトナム、 アダルト/ 肺炎 はい − 中咽頭 − + 病院 未知 洗う 11 ベトナム、 アダルト/ 肺炎 はい − 中咽頭 − + 病院 未知 洗う 12 ベトナム、 アダルト/ 肺炎 はい − 中咽頭 − + 病院 未知 洗う 13 ベトナム、 アダルト/ 肺炎 はい − 中咽頭 + + 病院 未知 洗う 14 ベトナム、 アダルト/ 肺炎 はい − 中咽頭 − + 病院 未知 洗う 15 ベトナム、 アダルト/ 肺炎 はい − 中咽頭 − + 病院 未知 洗う 16 ベトナム、 46歳/月 肺炎 はい + 鼻、 +¶ + 病院 口腔咽頭 綿棒 17 カナダ、 43歳/月 肺炎 はい まだ完成してない 肺、骨 − 家族 骨髄 18 台湾、 51歳/女 肺炎 はい − 喀痰 − + 家族 19 ホン 大人/女性 肺炎 はい + 中咽頭 − + コング、 洗う ホテル *プラス記号は肯定的な結果を示し、マイナス記号は否定的な結果を示します。 血清学的アッセイおよび RT-PCR アッセイは、必ずしも同時に採取されたサンプルに対して実行されるわけではありません。 †これは後期の検体で、最初の検体では抗体陽性でした。 ‡旅行には中国、香港（ホテル）、ハノイが含まれます（患者はフランス病院の初発患者でした）。 §分離は腎臓のみからでした。 ¶分離は中咽頭からのみでした。
Vero E6 細胞の CPE は、接種後 5 日目に初めて認められました。 それは局所的であり、細胞が丸くなり、影響を受けた細胞に屈折が見られ、その後すぐに細胞剥離が起こりました（ イチジク。 1A ）。 CPE は急速に広がり、24 ～ 48 時間以内に細胞単層全体を巻き込みました。 マスターシードストック（その後の抗原産生に使用）の調製後の材料の継代培養により、上記のようにCPEが急速に出現し、接種されたフラスコ内の単層は48時間以内に完全に破壊されました。 同様の CPE は、さらに 4 つの培養物でも認められました。呼吸器標本の培養物 3 つ (口腔咽頭洗浄液 2 つと喀痰標本 1 つ)、および剖検で得られた腎臓組織の懸濁液の培養物 1 つです。 これらの標本では、最初の CPE は 2 日目と 4 日目の間に観察され、上記のように、CPE は急速に進行して細胞単層全体を巻き込みました。
CPEを示す組織培養サンプルを電子顕微鏡検査用に調製しました。 ネガティブ染色電子顕微鏡標本は、2.5% パラホルムアルデヒドと 1:1 で混合した培養上清をホルムバールカーボンでコーティングされたグリッド上で乾燥させ、2% タングステン酸メチルアミンで染色することによって調製されました。 薄切片電子顕微鏡標本は、洗浄した細胞ペレットを 2.5% グルタルアルデヒドで固定し、細胞ペレットをエポキシ樹脂に包埋することによって調製しました。 さらに、マスターシードストックは、培養フラスコを凍結融解し、1000×gでの遠心分離によって解凍内容物を清澄にし、液体窒素上の気相で保存されたアリコートに上清を分注することによって、残りの培養上清および細胞から調製した。 マスターシードストックを850cmに継代培養しました。 2 免疫組織化学分析用のホルマリン固定ポジティブコントロール細胞の調製用の Vero E6 細胞のローラーボトル。通常の Vero E6 細胞と混合し、IFA 検査用のスポットスライドの調製のためにガンマ線照射するか、または界面活性剤で抽出してガンマ線照射して次の用途に使用します。抗体検査用のELISA抗原。
薄切片電子顕微鏡によるCPE陽性Vero E6細胞の検査により、粗面小胞体の槽内および小胞内に特徴的なコロナウイルス粒子が明らかになった( イチジク。 2A ）（ベッカーら、 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１ ：１０１９−２７、１９６７；オシロら、 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１２ ：１６１−８、１９７１）。 細胞外粒子は大きなクラスターとなって細胞膜の表面に付着していることが見られました。 ネガティブ染色電子顕微鏡検査により、直径80～140nmで、周囲を取り囲む20～40nmの複雑な表面突起を持つコロナウイルス粒子が確認されました( イチジク。 2B ）。 ヘマグルチニンエステラーゼ型糖タンパク質の突起は見られなかった。
Vero E6 細胞におけるヒト由来コロナウイルスの分離と増殖は予想外でした。 これまでに知られているヒトコロナウイルスは、特にこだわりが強く、増殖には選択された細胞株、器官培養物、または哺乳マウスを好みます。 Vero E6 細胞内で増殖することが示されている唯一のヒトまたは動物のコロナウイルスは PEDV であり、細胞内で増殖するには培地にトリプシンを添加する必要があります。 さらに、Vero E6 細胞での増殖に適応した PEDV は、細胞質空胞と大きな合胞体の形成を伴う、著しく異なる CPE をもたらします。 合胞体細胞は、SARS-CoVに感染したVero E6細胞の単層で時折観察されるだけだった。 それらは明らかに支配的な CPE を代表していません。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応と配列決定
RT-PCR アッセイでは、細胞培養上清を溶解バッファーに入れました。 RNA抽出物は、自動NucliSens抽出システム（bioMérieux、ノースカロライナ州ダーラム）を用いて各標本（または培養上清）100μlから調製しました。 最初に、縮重イノシン含有プライマー IN-2 (+) 5'GGGTTGGGACTA TCCTAAGTGTGA3' (配列番号 34) および IN-4 (-) 5'TAACACACAACICCATCA TCA3' (配列番号 35) をアニールするように設計しました。利用可能なコロナウイルス ORF1a、ORF1b、S、HE、M、および N 遺伝子配列のアラインメントに基づいて同定された、保存されたアミノ酸モチーフをコードする部位。 追加の SARS 特異的プライマー Cor-p-F2 (+) 5'CTAACATGCTTAGGATAATGG3' (配列番号 13)、Cor-p-F3 (+) 5'GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC3' (配列番号 14)、および Cor- ｐ－Ｒ１（－）５'ＣＡＧＧＴＡＡＧＣＧＴＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣ３（配列番号１５）は、縮重プライマーで増幅されたＲＴ－ＰＣＲ産物から配列が生成されるように設計された。 これらの SARS 特異的プライマーは、患者検体の SARS 検査に使用されました (以下を参照)。 ヒトメタニューモウイルスの特異的増幅に使用されるプライマーは、Falsey et al. によって記載されています。 ( J.感染する。 ディス。 87:785–90、2003)。
3 kb未満のRT-PCR産物の場合、500 ngのRNA、200 UのSuperscript™ II逆転写酵素（Invitrogen Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド）、40 UのRNasin（ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、ウィスコンシン州マディソン）、１００ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）、４μｌの５×反応緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）、および２００ｐｍｏｌのリバースプライマー。 逆転写酵素を除く反応混合物を７０℃に２分間加熱し、４℃に５分間冷却し、次いでサーモサイクラー中で４２℃に加熱した。 混合物を４２℃で４分間保持し、次いで逆転写酵素を添加し、反応物を４２℃で４５分間インキュベートした。 2 マイクロリットルの cDNA 反応液を、67 mM Tris-HCl (pH 8.8)、1 mM 各プライマー、17 mM 硫酸アンモニウム、6 mM EDTA、2 mM MgCl 2 、各 200 mM dNTP、および２．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）。 ＰＣＲ用のサーモサイクラープログラムは、９５℃で３０秒間の変性、４２℃で３０秒間のアニーリング、および６５℃で３０秒間の伸長の４０サイクルから構成された。 SARS-CoV 特異的プライマーの場合、アニーリング温度は 55℃ に上昇しました。
3 kbより長い断片の増幅では、既知の配列のセクション間のゲノム領域が、長いRT-PCRプロトコルとSARS-CoV特異的プライマーを用いて増幅されました。 第一鎖ｃＤＮＡ合成は、若干の変更を加えた製造業者の指示に従って、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、４２℃または５０℃で行った。 コロナウイルス特異的プライマー（500 ng）およびSARS-CoV RNA（350 ng）をPCRヌクレオチドミックス（Roche Molecular Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス）と混合し、94℃で1分間加熱し、4℃に冷却した。サーモサイクラー中で３０℃に加熱した。 ５×ファーストストランド緩衝液、ジチオスレイトール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）、およびプロテクターＲＮアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）を添加し、サンプルを４２℃または５０℃でインキュベートした。 ３０℃で２分間加熱する。 逆転写酵素(200U)を添加した後、サンプルを42℃または50℃で1.5〜2時間インキュベートした。 サンプルを７０℃で１５分間不活化し、続いて２ＵのＲＮａｓｅ Ｈ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）で３７℃で３０分間処理した。 5 ～ 8 kb フラグメントの長い RT-PCR 増幅は、「ホット スタート」PCR に Taq Plus Precision (Stratagene、カリフォルニア州ラホーヤ) および AmpliWax PCR Gem 100 ビーズ (Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ) を使用して実行されました。以下の熱サイクルパラメータを用いる：94℃で1分間の変性、その後の94℃で30秒間、55℃で30秒間の35サイクル、72℃まで毎秒0.4度の上昇、 72℃で7～10分間、最終伸長は72℃で10分間行う。 RT-PCR産物を0.9%アガロースTAEゲルでの電気泳動によって分離し、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen, Inc.、サンタクラリタ、カリフォルニア州)の使用によって精製した。
すべての場合において、RT-PCR産物は、QIAquick Gel Extractionキット(Qiagen, Inc.、カリフォルニア州サンタクラリタ)を用いて配列決定のためにゲル単離および精製された。 両方の鎖を、蛍光ジデオキシチェーンターミネーター（Applied Biosystems; Foster City, CA）を使用する自動化方法によって配列決定した。
リーダーの配列は、N 遺伝子をコードするサブゲノム mRNA およびゲノム RNA の 5' 末端から得られました。 ｃＤＮＡ末端の５'急速増幅（ＲＡＣＥ）技術（Ｈａｒｃｏｕｒｔら、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７１：３３４－４９、２０００）を、Ｎ遺伝子または５'非翻訳領域に特異的なリバースプライマーとともに使用した。 RACE 産物は直接配列決定されるか、配列決定の前にプラスミド ベクターにクローン化されます。 SARS-CoVのリーダーに特異的なプライマーを使用して、ゲノムの5'末端とrep遺伝子の既知の配列の間の領域を増幅した。 ゲノムの 3' 末端は、オリゴ (dT) プライマーおよび N 遺伝子に特異的なプライマーを使用して配列決定のために増幅されました。
完全な SARS-CoV ゲノム配列が決定されると、ゲノム全体にわたる一連の独立して増幅された RT-PCR 産物の配列を決定することによって確認されました。 約 300 nt の間隔でポジティブセンスおよびネガティブセンスの配列決定プライマーを使用して、平均冗長性 9.1 の確認配列を生成しました。 確認配列は元の配列と同一でした。 ゲノム配列（配列番号１）は、２００３年４月２１日にＧｅｎＢａｎｋ配列データベース（アクセッション番号ＡＹ２７８７４１）に公開された。
配列解析
予測されたアミノ酸配列は、完全なゲノム配列情報が入手可能な各種を代表する参照ウイルスのアミノ酸配列と比較されました。グループ 1 の代表には、ヒト コロナウイルス 229E (GenBank アクセッション番号 AF304460)、ブタ流行性下痢ウイルス (GenBank アクセッション番号 AF353511)、伝染性胃腸炎ウイルス（GenBank Accession No. AF271965）。 グループ 2 の代表には、ウシ コロナウイルス (GenBank アクセッション番号 AF220295) およびマウス肝炎ウイルス (GenBank アクセッション番号 AF201929) が含まれていました。 グループ 3 は感染性気管支炎ウイルス (GenBank アクセッション番号 M95169) で代表されました。 一部の構造タンパク質の比較には、部分配列情報が入手可能な他のコロナウイルス種の代表的な株の配列が含まれていました。グループ 1 の代表的な株には、イヌ コロナウイルス (GenBank アクセッション番号 D13096)、ネコ コロナウイルス (GenBank アクセッション番号 AY204704)、およびブタ呼吸器コロナウイルス（GenBank Accession No. Z24675）。 グループ2の代表には、ヒトコロナウイルスOC43の3株（GenBankアクセッション番号M76373、L14643およびM93390）、ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（GenBankアクセッション番号AY078417）、およびラットコロナウイルス（GenBankアクセッション番号AF207551）が含まれた。
22:4673-80, 1994)を使用して、公開されているコロナウイルス配列とアラインメントされました ポリメラーゼ遺伝子の部分ヌクレオチド配列は、CLUSTAL W for Unix (バージョン 1.7; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 。 を使用した最大節約、距離、および最尤ベースの基準分析によって計算されました 系統樹は、PAUP (バージョン 4.0.d10; Swofford 編、 Phylogenetic Analysis using Parsimony and other Methods 、Sinauer Associates、マサチューセッツ州サンダーランド) 。 他のヒトおよび動物のコロナウイルスと比較した場合、この領域のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列の類似性スコアはそれぞれ 0.56 ～ 0.63 と 0.57 ～ 0.74 でした。 最も高い配列類似性は、グループ II コロナウイルスで得られました。 ヌクレオチド配列アラインメントから得られた最大節約ツリーを以下に示します。 イチジク。 3 。 ツリーの内部枝にある内部ノードのブートストラップ分析により、SARS-CoV が他の既知のコロナウイルスとは遺伝的に異なるという強力な証拠が得られました。
感染細胞培養物および非感染細胞培養物からのサンプルのマイクロアレイ分析（ウイルスファミリー内の高度に保存された領域に由来するアレイ要素を備えた長いオリゴヌクレオチド DNA マイクロアレイを使用）では、コロナウイルス科とアストロウイルス科の 2 つのウイルスファミリーに由来する 8 つのオリゴヌクレオチドのグループについて陽性シグナルが得られました（Wangら、 PNAS 99:15687–92、2002)。 すべてのアストロウイルスと 2 つのコロナウイルス オリゴヌクレオチドは、アストロウイルスとコロナウイルス ファミリーの 2 つのメンバーである鳥伝染性気管支炎と七面鳥コロナウイルスの最末端 3' 末端にマッピングされるコンセンサス配列モチーフを共有しています (Jonassen et al.、 J. Gen. Virol. 79:715–8、1998)。 結果は、分離株がコロナウイルスであることと一致しました。
追加の配列アラインメントおよび隣接結合ツリーは、 ClustalX (Thompson et al., Nucleic Acids Res. Gonnet タンパク質比較行列を備えた 25:4876-82, 1997) バージョン 1.83 を使用して生成されました。 結果のツリーは、treetool バージョン 2.0.1 を使用して最終出力用に調整されました。 未補正のペアワイズ距離は、Wisconsin Sequence Analysis Package、バージョン 10.2 (Accelrys、Burlington、MA) の Distances プログラムを使用して、整列した配列から計算されました。 距離は100から引くことで同一性パーセントに変換した。rep遺伝子によってコードされる3つの明確に定義された酵素タンパク質およびSARS-CoVの4つの主要な構造タンパク質のアミノ酸配列を、SARS-CoVの各種の代表的なウイルスのアミノ酸配列と比較した。完全なゲノム配列情報が入手可能なコロナウイルス（ イチジク。 4 、表2）。 結果として得られる系統図のトポロジーは非常に類似しています ( イチジク。 4 ）。 分析された各タンパク質について、種は確立された分類群と一致する単系統クラスターを形成しました。 いずれの場合も、SARS-CoV 配列は 4 番目のよく分離された分岐に分離されました。 これらのクラスターは、90% (1000 回の複製) を超えるブートストラップ値でサポートされていました。 以前に特徴付けられたコロナウイルス種間のペアワイズ比較（表 2）と一致して、酵素タンパク質（3CL）ではより高い配列保存が見られました。 プロ 、ポリメラーゼ（POL）、およびヘリカーゼ（HEL））は、構造タンパク質（S、E、M、およびN）の中でよりも優れています。 これらの結果は、SARS-CoV がこれまでに特徴づけられたコロナウイルスのいずれとも密接な関係がなく、コロナウイルス属内で別個のグループを形成していることを示しています。
表2 コロナウイルスタンパク質のペアごとのアミノ酸の同一性。 グループ ウイルス 3CLPRO ポール 全体 S そして M N ペアごとのアミノ酸の同一性 (パーセント) G1 HCoV-229E 40.1 58.8 59.7 23.9 22.7 28.8 23.0 PEDV 44.4 59.5 61.7 21.7 17.6 31.8 22.6 TGEV 44.0 59.4 61.2 20.6 22.4 30.0 25.6 G2 BCoV 48.8 66.3 68.3 27.1 20.0 39.7 31.9 MHV 49.2 66.5 67.3 26.5 21.1 39.0 33.0 G3 IBV 41.3 62.5 58.6 21.8 18.4 27.2 24.0 予測タンパク質長 (aa) SARS-CoV 306 932 601 1255 76 221 422 新型コロナウイルス感染症の範囲 302–307 923–940 506–600 1173–1452 76–108 225–262 377–454
例 2
被験者における SARS-CoV の検出
この例では、SARS-CoV 特異的プライマーを使用した患者検体における SARS-CoV の検出を示します。
SARS 特異的プライマー Cor-p-F2 (配列番号 13)、Cor-p-F3 (配列番号 14)、および Cor-p-R1 (配列番号 15) を使用して、患者検体を検査しました。サーズ。 GeneScan 解析を容易にするために、各セットの 1 つのプライマーの 5' 末端を 6-FAM で標識しました。 ワンステップ増幅反応は、Ｆａｌｓｅｙら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ ． ディス。 87:785–90, 2003。標準化されたウイルス RNA 抽出物を含む陽性および陰性 RT-PCR コントロールとヌクレアーゼフリー水が各実行に含まれました。 増幅された6-FAM標識産物を、GeneScanソフトウェア（バージョン3.1.2; Applied Biosystems; Foster City, CA）を備えたABI 3100 Prism Genetic Analyzerでのキャピラリー電気泳動によって分析した。 増幅産物が予想される産物サイズ（Cor-p-F2 または Cor-p-R1 の場合は 368 ヌクレオチド、Cor-p-F3 または Cor-p-R1 の場合は 348 ヌクレオチド）の 1 ヌクレオチド以内にある場合、検体は SARS-CoV に対して陽性であるとみなされました。 R1) 両方の特異的なプライマー セットについて、別の実験室での RNA 抽出物の別のアリコートからの 2 回目の PCR 反応によって確認されました。 DNA収量が十分である場合には、増幅産物の配列も決定されました。 さらに、上記のように、患者検体における SARS-CoV のマイクロアレイベースの検出が実行されました (Wang et al., PNAS 99:15687–92、2002 および Bohlander et al.、 Genomics 13:1322–24、1992)。
実施例３
気管支肺胞洗浄液の免疫組織化学的分析および組織病理学的分析、および電子顕微鏡分析
この例では、SARS-CoV に感染した Vero E6 細胞および SARS 患者の組織サンプルの免疫組織化学的、組織病理学的および電子顕微鏡的分析を示します。
SARS-CoVに感染したホルマリン固定パラフィン包埋Vero E6細胞とSARS患者から採取した組織をヘマトキシリン・エオシンおよび各種免疫組織化学染色で染色した。 免疫組織化学的アッセイは、ハンタウイルスに関して以前に記載された方法に基づいた(Zaki et al., Amer. J. Pathol. 146:552-79, 1995)。 簡単に説明すると、4 μm 切片を脱パラフィンし、再水和し、プロテイナーゼ K で 15 分間消化しました。 次に、スライドを、さまざまな既知のコロナウイルスに対する反応性を持つ動物種由来のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗血清または腹水、および SARS 患者の回復期血清検体とともに室温で 60 分間インキュベートしました。
一次抗体の最適希釈は、SARS 患者のコロナウイルス感染細胞と非感染細胞、または入手可能な場合には製造業者が推奨する濃度による滴定実験によって決定されました。 適切なビオチン化リンク抗体、アビジン-アルカリホスファターゼ複合体、およびナフトール-ファストレッド基質を順次適用した後、切片をマイヤーヘマトキシリンで対比染色し、水性封入剤で封入しました。 次の抗体および組織対照を使用しました:非感染動物からの血清検体、さまざまなコロナウイルス感染細胞培養物および動物組織、非感染細胞培養物、正常なヒトおよび動物組織。 患者からの組織は、他のさまざまなウイルス性および細菌性の肺病原体について免疫組織化学的アッセイによって検査されました。 さらに、薄切片電子顕微鏡評価のために 1 人の患者から BAL 標本が入手できました。
肺組織は、SARS 症状の発症から 14 ～ 19 日後に、3 人の患者の剖検と 1 人の患者の開腹肺生検によって採取されました。 コロナウイルス感染の臨床検査による確認的証拠は2人の患者（患者6および17）で入手でき、組織からのコロナウイルス核酸のPCR増幅、BAL液からのウイルス分離、またはコロナウイルスと反応する血清抗体の検出が含まれていた（表1）。 2 人の患者については、分子分析、細胞培養分析、または血清学的分析に使用できるサンプルがありませんでした。 しかし、どちらの患者もCDCのSARS症例の可能性の定義を満たしており、検査室で確認されたSARS症例と疫学的に強い関連性があった。 4 人の患者の肺組織の組織病理学的評価では、さまざまな進行度および重症度のびまん性肺胞損傷が示されました。 変化には、硝子膜の形成、間質性単核炎症性浸潤、および肺胞腔内の肺細胞の落屑が含まれます ( イチジク。 5A ）。 一部の患者で確認された他の所見には、限局性肺胞内出血、小気道の壊死性炎症性破片、器質化肺炎などが含まれます。 発症からそれぞれ14日後と17日後に死亡した2人の患者の肺胞内で、多核合胞体細胞が確認された。 これらの細胞には、切断され回旋した核を含む空胞化した細胞質が豊富に含まれていました。 明らかな核内または細胞質内のウイルス封入体は確認されませんでした（ イチジク。 5B ）、限られた数の合胞体細胞を電子顕微鏡で検査したところ、コロナウイルス粒子は検出されませんでした。 抗原グループ I、II、III のコロナウイルスと反応する一連の免疫組織化学染色を使用した場合、SARS 患者の組織では決定的な免疫染色は確認されませんでした。 クラミジア肺炎に対する免疫組織化学的染色を使用しても、患者組織の染色は確認されませんでし た さらに、インフルエンザウイルス A および B、アデノウイルス、ヘンドラウイルスおよびニパウイルス、ヒトメタニューモウイルス、RS ウイルス、麻疹ウイルス、マイコプラズマ肺炎、および 。
SARS 患者から分離されたコロナウイルスに感染した Vero E6 細胞の評価により、時折多核合胞体細胞を含むウイルス CPE が明らかになりましたが、明らかなウイルス封入体はありませんでした ( イチジク。 5C ）。 HCoV-229E、FIPV、TGEVなどの抗原グループIのコロナウイルスと反応するさまざまな抗体と、SARS患者の免疫血清検体を用いた免疫組織化学的アッセイでは、感染細胞の強力な細胞質および膜染色が実証されました。 イチジク。 5C および表3); ただし、同じ免疫ヒト血清サンプルおよび FIPV 抗原との交差反応性は観察されませんでした。 抗原性グループ II (HCoV-OC43、BCoV および MHV) またはグループ III (TCoV および IBV-Avian) のコロナウイルスと反応するいくつかのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれでも染色は確認されませんでした。 1人の患者から採取したBAL液を電子顕微鏡で検査したところ、コロナウイルスに感染した細胞が多数発見された（ 図１〜図４ 6A-B ).
表3 さまざまなポリクローナル グループ I 抗ウイルスの免疫組織化学的反応性 から分離されたコロナウイルスを含むコロナウイルス参照抗血清サンプル SARS と選択された抗原性グループ I コロナウイルスを持つ患者。 抗血清との免疫組織化学的反応性 コロナウイルスに感染した培養細胞 HCoV-229E SARS-CoV (マウス 3T3- FIPV-1 抗血清 (ベロE6) hAPN) (BHK-fAPN) 回復期～ + + − フェーズSARS (患者3) モルモット抗 + + − HCoV-229E ウサギアンチ + + + HCoV-229E 猫の抗 + + + FIPV-1 豚抗 + − + TGEV
実施例4
SARS-CoV血清学的分析
この例では、SARS-CoV の血清学的分析を実行する代表的な方法を示します。
スポットスライドは、ガンマ線照射した混合感染細胞と非感染細胞の懸濁液15μlを12ウェルテフロンコートスライド上に適用することによって調製した。 スライドを空気乾燥させた後、アセトンで固定した。 次いで、スライドを、ＩＦＡ試験に使用するまで－７０℃で保存した（ＷｕｌｆｆおよびＬａｎｇｅ、 Ｂｕｌｌ．ＷＨＯ ５２：４２９～３６、１９７５）。 ELISA抗原は、界面活性剤抽出とその後の感染Vero E6細胞のガンマ線照射によって調製した(Ksiazek et al., J. Infect. Dis. 179 (suppl. 1):S191-8, 1999)。 この抗原の使用に最適な希釈率 (1:1000) は、回復期の SARS 患者血清に対するチェッカーボード滴定によって決定されました。 同様に未感染のVero E6細胞から調製した対照抗原を使用して、試験した血清の特異的反応性を制御した。 使用した結合体は、それぞれ、ＩＦＡ試験およびＥＬＩＳＡ用に、フルオレセインイソチオシアネートおよび西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）に結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭであった。 新たに同定されたウイルスに対するさまざまな血清サンプルの特異性および交差反応性を、本明細書に記載の試験を使用して評価した。 この評価には、シンガポール、バンコク、香港の SARS 患者からの血清を、CDC 血清バンクからの健康な献血者および既知のヒト コロナウイルス (ヒト コロナウイルス OC43 および 229E) に感染した人の血清とともに使用しました (サンプルは E 社から提供されました)。 Walsh および A. Falsey、ロチェスター大学医歯学部、ニューヨーク州ロチェスター）。
感染細胞を含むスポットスライドは、回復期の SARS 患者の血清と反応しました ( イチジク。 1B ）。 香港、バンコク、シンガポール、および米国のSARSが疑われる患者の血清パネルをスクリーニングしたところ、感染細胞との高レベルの特異的反応が示され、陰性から陽性への反応性の転換やIFA検査での診断の上昇が示された。 4 の因数。 同様に、ELISA抗原を用いたこれらの同じ血清サンプルの試験では、回復期サンプルで高い特異的シグナルと、陰性から陽性への抗体反応性の変換または診断上の力価の増加が示されました（表4）。
表4 SARS における IFA アッセイと ELISA の両方を用いた血清学的検査の結果 患者は新たに分離されたヒトコロナウイルスの検査を受けた。 ソース 血清番号 発症からの日数 ELISA力価* IFA力価* 香港 1.1 4 <100 <25 香港 1.2 13 ≧6400 1600 香港 2.1 11 400 100 香港 2.2 16 1600 200 香港 3.1 7 <100 <25 香港 3.2 17 ≧6400 800 香港 4.1 8 <100 <25 香港 4.2 13 1600 50 香港 5.1 10 100 <25 香港 5.2 17 ≧6400 1600 香港 6.1 12 1600 200 香港 6.2 20 ≧6400 6400 香港 7.1 17 400 50 香港 7.2 24 ≧6400 3200 香港 8.1 3 <100 <25 香港 8.2 15 ≧6400 200 香港 9.1 5 <100 <25 （ハノイ） 香港 9.2 11 ≧6400 1600 バンコク 1.1 2 <100 <25 バンコク 1.2 4 <100 <25 バンコク 1.3 7 <100 <25 バンコク 1.4 15 1600 200 アメリカ 1.1 2 <100 <25 アメリカ 1.2 6 400 50 アメリカ 1.3 13 ≧6400 800 シンガポール 1.1 2 100 <25 シンガポール 1.2 11 ≧6400 800 シンガポール 2.1 6 100 <25 シンガポール 2.2 25 ≧6400 400 シンガポール 3.1 6 100 <25 シンガポール 3.2 14 ≧6400 400 シンガポール 4.1 5 100 <25 シンガポール 4.2 16 1600 400 ※希釈率の逆数
検査された限られた数のサンプルからの情報は、抗体が患者の症状発現後 1 ～ 2 週間の間に IFA アッセイおよび ELISA によって最初に検出可能であることを示唆しています。 （米国の献血者から）無作為に選択された384の血清サンプルのパネルのIFA検査とELISAでは、ELISAでの反応性が最小限だった1つの検体を除いて、新型コロナウイルスに対する抗体は陰性でした。 2 つの既知のヒトコロナウイルス OC43 に対する抗体（回復期血清中の相同ウイルス抗原に対する非常に高い力価）が診断上（4 倍以上）増加した、ペアのヒト血清サンプルのパネル（13 ペア）および229E（14ペア）は、IFA検査またはELISAのいずれにおいても、急性期血清中または回復期血清中で新たに分離されたコロナウイルスとの反応性を示さなかった。
実施例５
ポリ（Ａ） + RNAの単離とノーザンハイブリダイゼーション
この例では、Vero E6 細胞における SARS-CoV メッセージを検出するためのノーザン ハイブリダイゼーションの代表的な方法を示します。
感染または未感染のVero E6細胞からの全RNAを、製造者の推奨に従って使用したTrizol試薬(Invitrogen Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド)を用いて単離した。 ポリ(A) + Ｏｌｉｇｏｔｅｘ Ｄｉｒｅｃｔ ｍＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクラリタ）を使用し、バッチプロトコールの指示に従い、続いてエタノール沈殿を行うことにより、全ＲＮＡからＲＮＡを単離した。 1 cm から分離された RNA 2 の細胞を、3.7% ホルムアルデヒドを含む 0.9% アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、続いて部分アルカリ加水分解した (Ausubel et al. eds. Current Protocols in Molecular Biology , vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY) 、第 4.9 章、1996 年）。 RNAを真空ブロッティング(Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ)によってナイロン膜(Roche Molecular Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス)に転写し、UV架橋によって固定した。 プローブ合成用のDNAテンプレートは、ネガティブセンスリボプローブの生成を容易にするT7 RNAポリメラーゼプロモーターを含むリバースプライマーを使用して、SARS-CoV nt 29,083〜29,608（配列番号1）のRT-PCR増幅によって生成されました。 ジゴキシゲニン標識リボプローブのインビトロ転写、ハイブリダイゼーション、およびバンドの検出を、製造業者の推奨手順（Roche Molecular Biochemicals、インディアナポリス、インディアナ州）を使用してジゴキシゲニンシステムで実行した。 シグナルは化学発光によって可視化され、X 線フィルムで検出されました。
例6
SARS-CoVのゲノム構成
この例は、SARS-CoV ORF の位置を含む、SARS-CoV ゲノムのゲノム構成を示しています。
SARS-CoV のゲノムは 29,727 ヌクレオチドのポリアデニル化 RNA であり、残基の 41% が G または C です (公表されているコロナウイルス完全ゲノム配列の範囲は 37% ～ 42%)。 ゲノム構成はコロナウイルスに典型的で、特徴的な遺伝子順序 [5'-レプリカーゼ (rep)、スパイク (S)、エンベロープ (E)、膜 (M)、ヌクレオカプシド (N)-3'] と短い非翻訳領域を持っています。両方の終端 ( イチジク。 7A 、表5）。 SARS-CoV rep 遺伝子はゲノムの約 3 分の 2 を構成し、翻訳と同時にタンパク質分解プロセシングを受ける 2 つのポリタンパク質 (ORF1a および ORF1b によってコードされる) をコードします。 rep の下流には、すべての既知のコロナウイルスに共通する構造タンパク質 S、E、M、N をコードする 4 つの ORF があります。 血球凝集素エステラーゼ遺伝子。グループ 2 および一部のグループ 3 コロナウイルスの ORF1b と S の間に存在します (Lai および Holmes、 Fields Virology 編、Knipe および Howley 編、Lippincott Williams および Wilkins、ニューヨーク、4) 番目 版、2001 年、Ch. 35)、SARS-CoVでは見つかりませんでした。
コロナウイルスは、S と E の間、M と N の間、または N の下流に位置する多くの非構造タンパク質もコードしています。これらの非構造タンパク質は、コロナウイルス種によって大きく異なりますが、機能は不明であり、必須ではありません。ウイルス複製用 (Lai および Holmes、Fields Virology、Knipe および Howley 編、Lippincott Williams および Wilkins、ニューヨーク、4) 番目 版、2001 年、Ch. 35）。 SARS-CoV のゲノムには、50 アミノ酸を超える 5 つの非構造タンパク質の ORF が含まれています ( イチジク。 7B 、表5）。 274および154アミノ酸のタンパク質をコードする2つの重複するORF(それぞれX1(配列番号5)およびX2(配列番号6)と呼ばれる)は、S(配列番号4)とE(配列番号4)の間に位置する。 ： 7）。 ３つの追加の非構造遺伝子、Ｘ３（配列番号９）、Ｘ４（配列番号１０）、およびＸ５（配列番号１１）（それぞれ、６３、１２２、および８４アミノ酸のタンパク質をコードする）、は、Ｍ（配列番号８）とＮ（配列番号１２）との間に位置する。 上記の非構造タンパク質をコードする 5 つの ORF に加えて、M と N の間には 50 アミノ酸未満のタンパク質をコードする 2 つの小さな ORF もあります。 GenBank データベース (BLAST および FastA) の検索により、SARS-CoV のこれらの非構造タンパク質と他のタンパク質の間に有意な配列類似性がないことが示されました。
コロナウイルスの rep 遺伝子産物はゲノム RNA から翻訳されますが、残りのウイルスタンパク質は 3' 共末端の入れ子セットを形成するサブゲノム mRNA から翻訳され、それぞれの 5' 末端はゲノム 5' リーダー配列に由来します。 コロナウイルスのサブゲノム mRNA は不連続な転写プロセスを通じて合成されますが、そのメカニズムは明確には確立されていません (Lai and Holmes, in Fields Virology , eds. Knipe and Howley, Lippincott Williams and Wilkins, New York, 4) 番目 版、2001 年、Ch. 35; Sawicki と Sawicki、 Adv. 経験値 医学。 バイオル。 440:215–19、1998)。 SARS-CoVリーダー配列は、N遺伝子mRNAから合成された5'-RACE産物の配列とゲノムRNAから合成されたものとを比較することによってマッピングされた。 配列、ＡＡＡＣＧＡＡＣ（配列番号１のヌクレオチド６５〜７２）が、Ｎ遺伝子のｍＲＮＡおよびゲノム配列が分岐する部位のすぐ上流で同定された。 この配列は、ORF1a の上流および他の 5 つの ORF のすぐ上流にも存在し (表 5)、この配列が転写調節配列 (TRS) の保存されたコアとして機能することを示唆しています。
ゲノムの 5' 末端の部位に加えて、TRS 保存コア配列はゲノムの残りの部分に 6 回現れます。 SARS-CoV のゲノムにおける TRS の位置は、ポリ (A) テールを含まない 8.3、4.5、3.4、2.5、2.0、および 1.7 kb のサブゲノム mRNA が生成されると予測します ( 図１〜図４ 7A-B 、表5）。 3'-非翻訳領域 ( イチジク。 7C ）。 5 つの主要なバンドの計算されたサイズは、SARS-CoV の予測されるサブゲノム mRNA の 5 つのサイズに対応します。 他の少量の mRNA が存在する可能性は排除できません。 他のコロナウイルスとの類推により（Lai and Holmes、 Fields Virology 、Knipe および Howley 編、Lippincott Williams and Wilkins、ニューヨーク、4） 番目 版、2001 年、Ch. 35)、8.3 kb および 1.7 kb のサブゲノム mRNA はモノシストロン性で、それぞれ S および N の翻訳を指示しますが、複数のタンパク質は 4.5 kb (X1、X2、および E)、3.4 kb (M およびX3)、および 2.5 kb (X4 および X5) mRNA。 コンセンサス TRS は、予測された E タンパク質をコードする ORF の直接上流には見出されず、E をコードすると予測されるモノシストロン性 mRNA は、ノーザン ブロット分析では明確に同定できませんでした。 3.6 kb のバンドには複数の mRNA 種が含まれているか、E のモノシストロン性 mRNA が少量のメッセージである可能性があります。
表5 SARS-CoV ORF の位置とタンパク質と mRNA のサイズ ゲノムの位置 予測サイズ ORF TRS ある ORF スタート ORFエンド タンパク質(aa) mRNA (nt) b 1a 72 265 13,398 4,378 29,727 1b 13,398 21,482 2,695 S 21,491 21,492 25,256 1,255 8,308 c X1 25,265 25,268 26,089 274 4,534 c X2 25,689 26,150 154 そして 26,117 26,344 76 M 26,353 26,398 27,060 221 3,446 c X3 27,074 27,262 63 X4 27,272 27,273 27,638 122 2,527 c X5 27,778 27,864 28,115 84 2,021 d N 28,111 28,120 29,385 422 1,688 c ある この位置は、コンセンサス TRS、AAACGAAC の最も 3' 側のヌクレオチドです。 b ポリ(A)は含まれません。 予測されるサイズは、保存された TRS の位置に基づいています。 c ノーザンブロット分析により検出された対応するmRNA(図7C) d このコンセンサスTRSの利用に対応するmRNAはノーザンブロット分析によって検出されなかった(図7C)。
実施例7
SARS-CoV検出のためのリアルタイムRT-PCRアッセイ
この例では、患者検体中の SARS-CoV を検出するためのリアルタイム RT-PCR アッセイにおける SARS-CoV 特異的プライマーおよびプローブの使用を示します。
TaqMan プローブ加水分解技術 (Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ) に基づくリアルタイム形式の変種を使用して、SARS-CoV 感染が確認または疑われる 246 人から収集された合計 340 の臨床検体を分析しました。 検体には、口腔および鼻咽頭のスワブ（乾燥およびウイルス輸送媒体中）、喀痰、鼻の吸引液および洗浄液、BAL、および剖検時に収集された肺組織検体が含まれていました。
核酸抽出
SARS-CoV 核酸は、自動 NucliSens 抽出システム (bioMérieux、ノースカロライナ州ダーラム) を使用して臨床検体から回収されました。 製造業者の指示に従い、NucliSens溶解緩衝液に入れられた検体を断続的に混合しながら37℃で30分間インキュベートし、抽出キットに含まれる50μLのシリカ懸濁液を加えて混合した。 次に、チューブの内容物を核酸抽出カートリッジに移し、抽出ワークステーションで処理しました。 約 40 ～ 50 μL の総核酸溶出液をヌクレアーゼフリーのバイアルに回収し、すぐにテストするか、-70℃ で保存しました。
プライマーとプローブ
Primer Express ソフトウェアバージョンを使用して、SARS-CoV ポリメラーゼ 1b (配列番号 1 の核酸 13,398 ～ 21,482) およびヌクレオカプシド遺伝子 (配列番号 1 の核酸 28,120 ～ 29,385) 配列から複数のプライマーおよびプローブのセットを設計しました。 １．５または２．０．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を以下のデフォルト設定で使用した：プライマー融解温度（Ｔ Ｍ ）を６０℃に設定。 プローブＴ Ｍ は、 約７０℃のプライマーよりも１０℃高い温度に設定される。 5' プローブ末端ではグアニジン残基は許可されません。 すべてのプライマーとプローブは、標準的なホスホルアミダイト化学技術によって合成されました。 TaqMan プローブの 5' 末端をレポーター 6-FAM で標識し、3' 末端をクエンチャー Blackhole Quencher 1 (Biosearch Technologies, Inc.、カリフォルニア州ノバト) で標識しました。 最適なプライマーおよびプローブ濃度は、一定量の精製 SARS-CoV RNA に対する各プライマーの段階 2 倍希釈液の交差滴定によって決定されました。 最高の増幅効率を与えるプライマーおよびプローブの濃度をさらなる研究のために選択しました(表6)。
表6 リアルタイム RT-PCR アッセイに使用されるプライマーとプローブ ある ゲノム アッセイID プライマー/プローブ 順序 地域 一次診断アッセイ SARS1 F CATGTGTGGCGGCTCACTATAT (配列番号16) RNAポール R GACACTATTAGCATAAGCAGTTGTAGCA (配列番号:17) P TTAAACCAGGTGGAACATCATCCGGTG (配列番号18) SARS2 F GGAGCCTTGAATACACCCAAAG (配列番号19) ヌクレオカプシド R GCACGGTGGCAGCATTG (配列番号20) P CCACATTGGCACCCGCAATCC (配列番号21) SARS3 F CAAACATTGGCCGCAAATT (配列番号:22) ヌクレオカプシド R 配列番号:23 P CACAATTTGCTCCAAGTGCCTCTGCA (配列番号:24) 肯定的な結果を確認するには N3 F GAAGTACCATCTGGGGCTGAG (配列番号25) ヌクレオカプシド R CCGAAGAGCTACCCGACG (配列番号26) P CTCTTTCATTTTGCCGTCACCACCAC (配列番号:27) 3'-NTR F AGCTCTCCCTAGCATTATTCACTG (配列番号:28) 3'-NTR R CACCACATTTTCATCGAGGC (配列番号29) P TACCCTCGATCGTACTCCGCGT (配列番号30) M F TGTAGGCACTGATTCAGGTTTTG (配列番号31) Mプロテイン R CGGCGTGGTCTGTATTTAATTTA (配列番号32) P CTGCATACAACCGCTACCGTATTGGAA (配列番号33) ある RT-PCR、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応。 F、フォワードプライマー。 R、リバースプライマー。 P、プローブ。 NTR、非翻訳領域。
リアルタイム RT-PCR アッセイ
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲアッセイは、リアルタイムワンステップＲＴ－ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して実施した。 各 25 μL 反応混合物には、12.5 μL の 2× マスター ミックス、0.625 μL の 40× MultiScribe および RNase Inhibitor ミックス、0.25 μL の 10 μM プローブ、0.25 μL の 50 μM フォワードおよびリバース プライマー、6.125 μL のヌクレアーゼが含まれていました。遊離水、および 5 μL の核酸抽出物。 増幅は、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上の９６ウェルプレートで実施した。 サーモサイクリング条件は、逆転写のための４８℃で３０分間、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼの活性化のための９５℃で１０分間、および９５℃で１５秒および６０℃で１分の４５サイクルからなる。各実行には、1 つの SARS-CoV ゲノム テンプレート コントロール、抽出用の少なくとも 2 つのテンプレートなしコントロール (サンプル処理中の汚染を確認するため)、および PCR 増幅ステップ用の 1 つのテンプレートなしコントロールが含まれていました。 PCR 阻害剤のコントロールとして、また核酸抽出効率をモニタリングするために、各サンプルをリアルタイム RT-PCR でヒト リボヌクレアーゼ (RNase) P 遺伝子 (GenBank Accession No. NM) の存在についてテストしました。 −００６４１３ ）以下のプライマーおよびプローブを使用することにより：フォワードプライマー５'−ＡＧＡＴＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧ−３'（配列番号３６）； リバースプライマー 5'-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3' (配列番号37); プローブ５'−ＴＴＣＴＧＡＣＣ ＴＧＡＡＧＧＣＴＣＴＧＣＧＣＧ−３'（配列番号３８）。 使用したプライマー濃度がそれぞれ30μMであることを除いて、アッセイ反応は上記と同様に実施した。 蛍光測定を行い、ベースラインより上の平均値に標準偏差を 10 加えた値に設定された閾値限界を蛍光が超えた点を決定することによって、各サンプルの閾値サイクル (C T ) 値を計算しました。 2 つ以上の SARS ゲノム標的が陽性結果を示し (C T ≦ 45 サイクル)、すべての陽性および陰性対照反応が期待値を示した場合、検査結果は陽性とみなされます。
本開示は、好ましい実施形態に重点を置いて説明されてきたが、当業者には、好ましい実施形態の変形および均等物が使用され得ることは明らかであり、本開示は、具体的なもの以外の方法で実施され得ることが意図されている。ここに記載されています。 したがって、本開示は、特許請求の範囲によって定義される本開示の精神および範囲内に包含されるすべての変更を含む。
請求
配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子。
参考文献 引用文献
米国特許文書
20050181357 2005 年 8 月 18 日 ピーリスら。
外国特許文献
WO 2004/085633 2004 年 10 月 WO
WO 2004/092360 2004 年 10 月 WO
その他の参考文献
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GenBank アクセッション番号 AY278487、「SARS コロナウイルス BJ02、部分ゲノム」、バージョン AY278487.1、2003 年 4 月 21 日。
Genbank アクセッション番号 AY278554、「SARS コロナウイルス CUHK-W1、完全なゲノム」、バージョン AY278554.1、2003 年 4 月 18 日。
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特許の歴史
特許番号 ：7220852
タイプ： 付与
提出日 : 2004 年 4 月 12 日
特許日 : 2007 年 5 月 22 日
譲受人 : アメリカ合衆国疾病管理予防センター保健福祉省長官が代表 （ワシントンDC）
発明者 : ポール・A・ロタ (ジョージア州ディケーター) ラリー・J・アンダーソン (ジョージア州アトランタ) ウィリアム・J・ベリーニ (ジョージア州リルバーン) カーセル・バーンズと向き合う (ジョージア州エイボンデール エステーツ)、 レイモンド・カンパニョーリ (ジョージア州ディケーター) チー・チェン （ジョージア州マリエッタ） ジェームズ・A・カマー (ジョージア州ディケーター) シャノン・L・エメリー (ルサカ) ディーン・D・アードマン (ジョージア州ディケーター) シンシア・S・ゴールドスミス (ジョージア州リルバーン) チャールズ・D・ハンフリー (ジョージア州リルバーン) ジョセフ・P・アイスノーグル (ジョージア州アトランタ) トーマス・G・クシアゼク (ジョージア州リルバーン) スティーブン・S・モンロー (ジョージア州ディケーター) ウィリアム・アラン・ニックス (ジョージア州ベツレヘム)、 M・スティーブン大佐 (ジョージア州リルバーン) テレサ・CT・ペレ (ジョージア州アトランタ) ピーター・E・ローリン (ジョージア州リルバーン) マーク・A・パランシュ (ジョージア州リルバーン) アンソニー・サンチェス (ジョージア州リルバーン) スーシアン・トン (ジョージア州アルファレッタ)、 R・ザキ保安官 (ジョージア州アトランタ)
一次試験官 : Mary E. Mosher
弁護士 ： クラークイスト・スパークマンLLP
出願番号 : 10/822,904
分類
現在の米国クラス : ウイルスタンパク質 (536/23.72) ; ウイルスまたはバクテリオファージ（ウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターを除く） その組成； その調製または精製； ウイルスサブユニットの生産; 伝播用メディア (435/235.1)
国際分類 : C12N 15/50 (20060101); C12N 7/00 (20060101);
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