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オープンアクセス 記事
由来の銀ナノ粒子が ヨモギ 抗 がん効果とアポトーシス誘導効果を明らかに
に ヴァレンティーナ・ボルドーニ
1 , ルカ・サンナ
1 , ウェイドン・リュー
1,2 , エリザベッタ・アヴィタビレ
1 , ステファノ・ゾロッドゥ
1 , セレナ・メディチ
3 [オーシド] , デビッド・J・ケルビン
2,4 と ルイージ・バジェラ
1,5,* [オーシド]
1
サッサリ大学生物医科学部、Viale San Pietro 43/b、07100 サッサリ、イタリア
2
免疫部門、国際感染免疫研究所、汕頭大学医科大学、汕頭、515011、中国
3
サッサリ大学化学薬学部、Via Murani 23、07100 サッサリ、イタリア
4
ダルハウジー大学微生物学および免疫学部、6299 South St、ハリファックス、NS B3H 4R2、カナダ
5
バイオテクノロジーセンター、スバロ癌研究および分子医学研究所、テンプル大学科学技術学部、フィラデルフィア、ペンシルバニア州 19122、米国
*
通信の宛先となる著者。
内部。 Ｊ．Ｍｏｌ． 科学。 2021 、 22 (16)、8621; https://doi.org/10.3390/ijms22168621
受信日: 2021 年 7 月 12 日 / 改訂日: 2021 年 8 月 3 日 / 受理日: 2021 年 8 月 5 日 / 公開日: 2021 年 8 月 11 日
(この記事は 「生体異物の分子的役割 」セクションに属します)
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バージョンに関するメモ
概要
がんとの闘いは、医学研究にとっての主要な課題の 1 つです。 最近、ナノテクノロジーは大幅な進歩を遂げ、現在の治療法に共通する限界を克服する革新的なナノ材料を開発する可能性をもたらしました。 これに関連して、銀ナノ粒子 (AgNP) は、がん研究に興味深い応用を提供できる有望なナノツールです。 この道に従って、私たちは銀の特性と ヨモギ の と呼ばれる新しいナノ粒子を生成しました 特性を組み合わせて、ヨモギ-AgNP 。 「グリーン」合成法を実行して Artemisia-AgNP 抽出物を使用して、 Artemisia arborescens を生成しました。 この種の光合成は、環境に優しく、安価で迅速なアプローチです。 さらに、植物抽出物の生体有機分子は、 ヨモギ – AgNP の生体適合性と有効性を改善しました。 Artemisia -AgNP は完全に特性評価され、さまざまな癌細胞株、特に HeLa と MCF-7 に対する効果を比較するためにテストされました。 ヨモギ – AgNP の治療では、用量依存的な癌細胞の増殖阻害が示されました。 s 処理によって媒介される G1 停止を観察し、細胞周期に対するそれらの影響を評価しました さらに、ヨモギ – AgNP 。 治療後にクローン原性アッセイを使用すると、細胞コロニーが完全に欠如していることが観察され、細胞の再現性による死が実証されました。 可能性が実証されました。 遺伝子発現の影響についてより広範な概要を得るために、RNA シーケンスを実行しました。これにより、ヨモギ – AgNP ががん研究における適切な候補ツールとしての
キーワード:
がん研究 ; ナノテクノロジー ; 銀ナノ粒子 ; ヨモギ ; RNA配列
1. はじめに
現在、癌の発生率は急速に増加しており、世界中で 2 番目に多い死因であると考えられています [ 1 ]。 がんは、高い増殖指数といくつかの生理学的細胞機構の変化によって定義される疾患群です。 現在使用されている主な治療法は、手術、放射線療法、化学療法です。 これらの治療は、重篤な副作用、不完全な腫瘍切除、耐性の発現などの一般的な合併症を引き起こす可能性があります ] 2、3 [ 。 がんナノ医療は、腫瘍学的応用に潜在的なナノツールを提供することを目的とした新しい研究分野として浮上しています。 がんナノ医療の最終目標は、腫瘍の早期検出、正確な診断、個別化された治療を提供することです ] [ 4、5 。 がんナノ医療の主な利点は、より個別化された医療への道において、分子レベルで作用できるナノサイズの粒子を活用することにあります。 ここ数年、カーボン ナノチューブなどのいくつかのナノ粒子ががんの診断と治療のために研究されてきました。 6 ]、常磁性ナノ粒子 [ 7 ]、リポソーム [ 8 ]、金ナノ粒子 [ 9 ]、その他多数 [ 10 ]。 銀ナノ粒子 (AgNP) は、その興味深い物理化学的特性により、がん研究において大きな関心を集めています。 銀は、抗菌作用や抗真菌作用など、魅力的な生物学的特性を備えた貴金属です。 最近、いくつかの研究で、多数の銀化合物が癌細胞に多くの影響を与えることが示されました [ 11 ]。 銀は毒性が低いですが、同時に人体の解毒の効果的な生理学的メカニズムにより生体利用効率が低くなります。 したがって、AgNP は、この問題を回避するための優れたソリューションとなります。 実際、AgNP はエンドサイトーシスやその他の取り込み機構を通じて細胞に取り込まれ、標的部位で銀の反応種である Ag+ イオンを放出します [12 ] 。 いくつかの研究では、AgNP が活性酸素種を介して細胞毒性を誘発することが示されています [ 13 ]。 それにもかかわらず、AgNP の生物学的メカニズムをよりよく理解するには、さらなる研究が必要です。
ここ数年、AgNP を製造する代替方法として「グリーン」合成が登場しています。 このアプローチは、植物、細菌、真菌抽出物からの生合成に基づいているため、簡単、安価、そして環境に優しいです [ 14 ]。 「グリーン」手順では、銀塩、通常は硝酸銀 (AgNO 3 ) を植物抽出物に添加して、溶液中に存在する生体分子が銀イオンを金属ナノ粒子に還元できるようにします。 この反応に関与している主な生体分子は、テルペノイド、ポリフェノール、酵素、タンパク質です。 ナノ粒子の形状と寸法は、抽出物の起源、温度、溶液の pH によって影響されます。 これらの特性は、AgNP の生物学的応答に影響を与えます [ 15 ]。 さらに、生体分子、特にタンパク質や酵素が反応媒体中に存在し、これらは「キャッピング」と呼ばれる層として粒子の表面に分布します。 さらに、キャッピングは AgNP の生物学的活性に影響を与えます。 実際、いくつかの研究で示唆されているように、表面にキャッピングを有するナノ粒子は、そうでないナノ粒子と比較して生体適合性が高い。 「キャップ付き」ナノ粒子は細胞毒性が低いですが、「裸の」ナノ粒子と比較してより効果的であるようです [ 16 , 17 ].
したがって、我々は ヨモギ の抽出物を使用して生物学的に活性なAgNPを合成しました。 の使用は 典型的な地中海植物であるヨモギ 属に属し 、それがヨモギ 、その種がさまざまな症状を治療するための伝統的または民間療法として世界中で使用されているという事実に基づいています。 たとえば、主要な抗マラリア薬の 1 つであるアルテミシニンは、 A. annua で発見されました[ 18 ]。 同じ分子とその合成誘導体が癌に対して試験されており、有望な結果が得られてい ] 19、20、21 ます 現在、 [ 。 一般に、 ヨモギ 属のほとんどの種は、葉や花に有用なテルペンやツジョンが存在するため、潜在的な薬理効果を示します。 の薬理学的特性は、 実際、 A. arborescens いくつかの医療目的で研究中です [ 22 発熱、咳、マラリアを治すための煎じ薬としての伝統的な消費に続き、 ]。 多くの ヨモギ 属は癌治療用の AgNP を調製するために使用されていますが、私たちの知る限りでは、 A. arborescens は、 この観点に基づいてまだ調査されていません。 そこで、我々は癌細胞に対するそれらの挙動を試験し、その結果を本論文で報告する。 の 3 つの異なるバッチを合成し ヨモギ – AgNP 我々は、異なる pH 値 (7、8、および 9) で 、構造の詳細と形態を理解するために完全に特性評価しました。 これらのナノ粒子は、HeLa や MCF-7 などのがん細胞株でテストされています。 で 24 時間および 48 時間処理した癌細胞では、用量依存的な細胞傷害作用が見られました Artemisia-AgNP 。 細胞生存率に対する主な影響は、 ヨモギ – AgNP 他のものと比較して、pH 7 で合成された s 処理後 によって媒介されました。 Artemisia – AgNP 、G1 停止とアポトーシス細胞の増加が観察されました。 s 処理後の細胞コロニーの大幅な減少が見つかり クローン原性アッセイを通じて、ヨモギ – AgNP 、細胞再生の死が実証されました。 さらに、RNA シーケンスを実行して、生物活性の広範な概要を取得しました。 ヨモギ – AgNP は、遺伝子発現と DNA 損傷応答を制御します。 可能性を示唆しており、これを利用してがん研究におけるさらなる分析への道を開くことができます。 総合すると、これらの予備データは、ヨモギ – AgNP が優れた抗がん候補ツールとしての
2. 結果
2.1. ナノ粒子の特性評価と XTT 分析
サイズは、ナノ粒子の生物活性を決定する基本的な要素です。 一般に、サイズが小さいほど活性が高いことが観察されています [ 23 ]。 それにもかかわらず、非常に小さな粒子は細胞に毒性を及ぼす可能性があり、10 nm 未満のナノ粒子は溶血を引き起こす可能性があるため、生物学的実験には適さない場合があります [24 ] 。 それにもかかわらず、それらの表面にキャップが存在すると、それらの活性が容易に調節され、毒性が低くなり、より活性で生体適合性が高くなります。 したがって、ナノ粒子の寸法を調整することによって活性と毒性の間のバランスを見つけることが重要です。 これを行う良い方法は、一般的により高い pH がより小さな粒子に対応することを知って、ナノ粒子が合成される溶液の pH を制御することです [ 25 ]。 その結果、溶液中のpHを調整することによってAgNPの寸法を制御するために、すでに使用されている手順が修正されました[ 26 ]。 したがって、 ヨモギ – AgNPの 3 つの異なるバッチ 予想通り、pH の変化によってサイズが変化するかどうかだけでなく、キャップのキャッピング、ひいては生物学的挙動にも影響を与えるかどうかを調べるために、異なる pH 値 (7、8、9) でサンプルが調製されました。 13,000 rpm での超遠心分離は、回収される AgNP の収量を増加させ、トレーニング手順を短縮するために導入され、合成プロセスを大幅に改善しました。
AgNP の構造的特徴を研究するために、AgNP の完全な特性評価が実行されました。 紫外可視スペクトルは、420 付近にプラズモニック ピークを示し ( 図 1A )、これらのナノ粒子の推定サイズが 10 ～ 30 nm である回転楕円体の形状を示唆しています [ 27 ]。 DLS 分析により、AgNP のサイズ分布は反応溶液の pH に応じて変化することがわかりました。 予想通り、pH の増加により流体力学半径の減少が決定され [ 28 であることが判明しました。 ]、pH 7 の AgNP では約 30 nm (図 1 B)、pH 8 の AgNP では約 15 nm、pH 4 では約 15 nm 合成から数週間後に測定したところ、寸法が時間の経過とともに一定のままであることが証明され、これらの粒子がかなり安定していることが示されました。
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図 1. Artemia -AgNP の特性評価。 ( A ) 3 つのナノ粒子すべての主な特性を示す表。 ( B ) 420 nm にプラズモニック ピークを示す、pH 7 での AgNP の選択された UV-vis スペクトル。 ( C ) pH 7 での AgNP の選択された DLS 測定。
TEM 分析により、AgNP のサイズと形態に関する情報が確認され、ほとんどの場合、形状は回転楕円体であり、平均寸法は 50 nm をはるかに下回っていました。 に示す TEM 画像は、 図 2A pH 7 で得られたナノ粒子の形態を示しており、回転楕円体の形状と水中での凝集がないことを特徴としています。 EDX プロファイルを使用してナノ粒子の元素構造を評価し ( 図 2 B)、ナノ粒子の銀組成を強調しました。 スペクトルに示されている他の元素は、使用されている穴のあるカーボン/銅グリッドによるものです。
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図2. TEM 分析、EDX プロファイル、FTIR 測定。 ( A ) pH 7 での AgNP の TEM 画像。( B ) 元素 Ag の存在を示す EDX プロファイル (Cu シグナルは使用したグリッドによる)。 ( C ) pH 7 で合成された AgNP の FTIR スペクトル。スペクトルは 400 ～ 4000 cm の範囲で取得されました。 −1 .
FTIR 測定は、400 ～ 4000 cm の範囲で信号を記録することによって実行されました。 −1 解像度4cm −1 、キャッピング分子に関するより多くの情報を取得するために。 すべてのサンプルからの FTIR スペクトルはほぼ同一であり、類似した組成を示しました ( 図 2 C)。 葉抽出物のアミン、タンパク質、または（ポリ）フェノール化合物が 観察されたバンドは、ヨモギ キャッピングの形成に関与している可能性があることを示唆しています。 3100～3600cmの広帯域 −1 OH と NH の両方の伸縮周波数が組み込まれており、信号は約 2900 cm です。 −1 炭化水素部分の sp3 CH 伸縮モード、および 1630 (νC=O) ～ 1000 cm の間の伸縮モードに起因すると考えられます。 −1 おそらく、アミド化合物 (つまり、タンパク質や酵素) またはアミンが原因であると考えられます。
AgNP の 3 つのバッチの特性評価では、それらはすべて回転楕円体の形状であり、同じキャッピング分子を共有していましたが、それらが得られたときの pH が実際にその寸法に影響を与える可能性があり、予想どおり、より高い pH はより小さなナノ粒子に対応することがわかりました。 。
当社の AgNP の抗腫瘍効果を確認するために、ヨモギ – AgNP (pH 7、pH 8、および pH 9) の用量を増加させて (0.5 ～ 20 μg/mL)、さまざまな細胞癌株 (HeLa、MCF-7、および PC3) を処理しました。 XTTアッセイにより細胞生存率を評価するため。 我々は、ヨモギ – AgNP の用量依存的な抗増殖効果を観察しました。 生存率の低下は、用量依存的に細胞生存率が低下するため、他のものと比較してヨモギ – AgNP pH7 でより関連性が高かった (図 3A )。 、細胞死を誘導する能力を実証しました [ 29、30 は、AgNP が細胞増殖を阻害し 他の研究で ]。 さらに、細胞傷害作用は AgNP のサイズと表面積に影響されることが示されました [ 31 ]。 サイズの違いによる AgNP の異なる作用に関して、最近の証拠は、溶血のリスクなしにナノ粒子の最大の生物学的活性を達成するために、細胞取り込みに適切なサイズは約 40 ～ 50 nm であることを示唆しています [32 ] 。
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図3. XTTアッセイ。 ( A ) HeLa、MCF-7、および PC3 を、各ヨモギ – AgNP (pH 7、pH 8、および pH 9) の用量を増加させて (0.5 ～ 20 μg/mL) 処理しました。 XTT アッセイを実行して細胞生存率を評価しました。 ( B ) HeLa および MCF-7 でのヨモギ – AgNPs pH7 の XTT アッセイ。 HeLa および MCF-7 を、2、5、および 10 μg/mL のヨモギ – AgNP (pH 7) で培養しました。細胞生存率は、XTT アッセイを使用して評価しました。 ( C ) 顕微鏡画像。 HeLa および MCF-7 を 7 μg/mL のヨモギ – AgNPs pH 7 で 24 時間処理しました。データはスチューデントの t 検定を使用して分析されました、* = p 値 < 0.05、** = p 値 < 0.01、*** = p 値< 0.001。
さらに、 図 3A で報告されているように、ヨモギ属 AgNP pH7 の抗増殖活性は、PC3 と比較して HeLa および MCF-7 でより明らかです ( 図 3A )。 私たちの結果によれば、Sadegh et al. は、グリーン合成を使用して合成された AgNP が MCF-7 細胞株に対してより選択的な活性を示すことを観察しました [ 33 ]。
これらのデータに基づいて、HeLa および MCF-7 に対する特定の効果を明らかにするために、さらなる分析のためにヨモギ – AgNPs pH7 を選択しました。 したがって、細胞毒性効果を検証するために、2、5、および 10 μg/mL の濃度のヨモギ – AgNPs pH 7 を使用して、XTT アッセイを 24 時間および 48 時間で繰り返しました。図 3 B に示すように、ヨモギ – AgNPs pH 7 は 、特に 5 ～ 10 µg/mL の濃度で高い抗増殖効果が見られます。 したがって、以下の実験では、7 µg/mL のヨモギ – AgNP (pH7) が細胞生存率を大幅に低下させる理想的な濃度であると考えられました。 の顕微鏡画像は、 図 3C 7 μg/mL の Artemisia – AgNPs pH7 で 24 時間処理した後の細胞を明確に示しています。 対照と比較して、ほとんどの細胞はプレートから剥離する際に損傷を受け、処理後に死滅しました。
2.2. 細胞周期への影響
細胞周期への影響を評価するために、細胞を 7 μg/mL のヨモギ – AgNP で 6 時間および 18 時間処理しました。 興味深いことに、対照サンプルと比較して、わずか 6 時間の処理後に G2/M 期の HeLa 細胞数の大幅な減少が見られました ( 図 4A )。 18 時間のインキュベーションで、G0/G1 期の細胞の停止が明らかでした ( 図 4A )。 同様の結果がヨモギ-AgNPで処理したMCF-7細胞株でも見られました（ 図4B ）。 特に、18 時間のインキュベーション後、G0/G1 期の増加に伴い、G2/M 期の細胞の割合が大幅に減少しました。 さらに、細胞死の指標である SubG1 期の関連する増加が観察されました ( 図 4B )。 AgNP が媒介する癌細胞の細胞周期への影響は、他の研究によって分析されました。 10 ～ 50 μg/mL の AgNP に 24 時間曝露すると、HeLa 細胞上の SubG1 集団の関連増加が決定され、細胞は G2 チェックポイントを通過できなくなりました [34 ] 。 私たちの結果とは対照的に、他の著者らは肺上皮細胞および神経膠芽腫細胞上の AgNP を研究し、治療後の G1 集団の減少を伴う G2/M 期細胞の増加を観察しました。 35 ]。 細胞周期データのこの相違は、細胞株、AgNP の異なる合成、AgNP の生物学的挙動を変化させる可能性があるキャッピングの存在などのさまざまな要因によるものである可能性があります。 それにもかかわらず、AgNP によって媒介される細胞周期の影響をよりよく理解するには、さらなる研究が必要です。
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図4. 細胞周期分析。 ( A ) HeLa 細胞を 7 μg/mL のヨモギ – AgNP (pH 7) で処理するか、未処理のまま放置しました。 6 時間後と 18 時間後にフローサイトメトリーによって細胞周期を評価しました。 ( B ) MCF-7 細胞を HeLa と同じ条件で処理し、細胞周期の影響をフローサイトメトリーで評価しました。
2.3. ヨモギ – AgNP はがん細胞のアポトーシスを誘導し、コロニー形成を阻害する
細胞周期分析に続いて、アポトーシス細胞と壊死細胞を区別するために、アネキシン V/7aad アッセイを実行しました。 死細胞数を増やすために、細胞を 7 μg/mL の Artemisia-AgNPs pH7 とともに 24 時間インキュベートしました。 私たちは、ヨモギ属 – AgNP が両方の細胞株で有意なアポトーシス効果を誘導し、壊死細胞がわずかに増加したことを確認しました（ 図 5A ）。 私たちのデータと一致して、さまざまな研究により、AgNP がいくつかの癌細胞株でアポトーシスを誘導する能力が実証されています ] 36、37 [ 。 いずれの場合でも、高用量の AgNP による治療は、蔓延する壊死効果を引き起こす可能性があります [ 38 ]。
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図5. アポトーシスおよび細胞コロニー形成アッセイ。 ( A ) アポトーシス/ネクローシスアッセイ。 左側のコントロールサンプル、右側のサンプルは 7 µg/mL のヨモギ – AgNPs (pH 7) で処理しました。HeLa 細胞の上、MCF-7 細胞の下。 細胞をアネキシン V/7aad で染色し、フローサイトメトリーで分析しました。 ( B ) クローン原性アッセイ。 最初のコロニーの形成後、細胞を 7 μg/mL のヨモギ – AgNP (pH 7) で処理しました。細胞コロニーを染色して計数しました。
さらに、クローン原性アッセイを使用して、ヨモギ – AgNP pH7 の細胞コロニー形成を阻止する能力を評価しました。 図 5B は、 7 μg/mL のヨモギ – AgNP (pH7) によって媒介されるクローン増殖阻害を明確に示しています。
2.4. ヨモギ – AgNP が遺伝子発現に与える影響
ヨモギ – AgNP の作用機序を解明するために、遺伝子発現への影響を広範囲に把握するために、HeLa 細胞の RNA シーケンスを実行しました。 6 時間および 18 時間の処理後、有意差の参照指標として log2 倍率変化値および p 値をパラメーターとして使用して、いくつかの発現差のある遺伝子 (DEG) を観察しました ( 図 6 A)。 図６Ｂ は、遺伝子変異を詳細に示す：６時間の処理後には２２８６個の上方制御遺伝子および３２８個の下方制御遺伝子が示され、１８時間の処理後には２０８０個の上方制御遺伝子および３１６個の下方制御遺伝子が示される。
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図6. 差次的に発現される遺伝子。 ( A ) 差分遺伝子の火山地図。 DEG は、ヨモギ – AgNP 処理の 6 時間および 18 時間後に設定されました。 赤い点は上方制御された遺伝子を示し、緑の点は下方制御された遺伝子を示し、黒い点は有意差がない遺伝子を示します。 (|logFC| ≥ 2 および p 値 < 0.05)。 a: CTR 対 6 時間。 b: CTR 対 18 時間。 c: 6 時間対 18 時間。 ( B ) 差次的遺伝子のヒストグラム。 DEG セットはヨモギ – AgNPs 処理によって乱れました (|logFC| ≥ 2 および p 値 < 0.05)。
その後、遺伝子オントロジー (GO) 解析にオンライン ソフトウェアである OmicShare ツールを使用し、差次的発現遺伝子 (DEG) の機能を研究できるようにしました。 詳細には、これらのツールを通じて、DEG と相関する細胞成分、生物学的プロセス、および分子機能を評価することが可能です。 6 時間と 18 時間でも同様の結果が得られました。 ヨモギ – AgNP は細胞内レベルで機能するようであり、濃縮された遺伝子は主に細胞小器官とその膜で発現されます ( 図 7 )。 生物学的プロセスに関しては、主なアップレギュレーション遺伝子は代謝プロセスおよび生物学的調節と相関していました。 DEG の分子機能は主に結合、触媒活性、分子機能調節に関与しています。
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図7。 GO分析。 DEG の 6 時間および 18 時間の治療に対する GO アノテーション。 濃縮された遺伝子の数が表示されます。
差次的に発現される遺伝子をさらに特徴づけるために、関与する代謝経路およびシグナル伝達経路を調査するために、KEGG 経路分析を実施しました。 分析により、DEGと細胞の代謝、翻訳、および折り畳みプロセスとの間に強い関連性があることが示されました( 図8 )。 さらに、いくつかの DEG はシグナル伝達、細胞の増殖および細胞死とも相関していました。 ヒトの疾患に関しては、ヨモギ – AgNP 治療と相関する DEG は主に感染症と癌に多く見られます。
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図8。 KEGG分析。 DEG に関与する経路は、KEGG 分析を使用して分析されました。 濃縮された遺伝子の数と経路用語が表示されます。
タンパク質間相互作用 (PPI) ネットワークを調査するために、オンライン マッピング ツール (NetworkAnalyst3.0) を使用しました ( 図 9 A)。 PPI ネットワーク分析により、程度ごとにハブ遺伝子として分類された上位 15 個の遺伝子が評価されました。 以下はハブ遺伝子の名前です: UBC、UBA52 (肝癌細胞アポトーシス中に過剰発現)、RPS27A (細胞悪性化)、RPS3 (細胞アポトーシス制御)、FAU (ヒト前立腺、乳房、卵巣で下方制御)がん）、RPL7（細胞アポトーシス制御）、RPL23A、RPL4（自己翻訳制御 - 大腸菌 ）、RPLP0（腫瘍進行、浸潤、転移）、RPS5、RPL9、RPS14、RPS2、RPL3、およびRPL23。 これらの遺伝子はユビキチン-リボソームタンパク質をコードしており、がんの形成や進行と相関する細胞機構などのさまざまな生物学的事象に関与しています。 ユビキチンは、タンパク質に共有結合し、タンパク質の翻訳後修飾を引き起こす、高度に保存された制御タンパク質です。 ユビキチン化は、細胞周期の進行と細胞増殖にとって重要なイベントです。 このプロセスの変化は癌の発生と関連しています [ 39 ]。 ハブ遺伝子間の関連を明らかにするために、ハブ遺伝子の PPI 解析も実行しました ( 図 9B )。 したがって、機能および経路濃縮分析を通じて、遺伝子発現の制御、DNA損傷応答、ゲノムヌクレオチド切除修復、およびリボソームなどのいくつかの生物学的プロセスにおけるこれら15個のハブ遺伝子の関与を特定しました（表1 ） 。
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図9。 PPI分析。 ( A ) DEG の PPI ネットワーク。 ノードは異なる遺伝子を表し、ノード間の接続により遺伝子間の相互作用が明らかになります。 ノードのサイズは遺伝子の程度を示し、さまざまな色は個別の遺伝子発現を表します (赤はアップレギュレートされた遺伝子、紫はアップレギュレーションが低い遺伝子です)。 ( B ) ハブ遺伝子の PPI ネットワーク。 トップハブ DEG との共発現ネットワーク。
表1。 GO および KEGG による上位 15 のハブ遺伝子の濃縮。
テーブル
3. ディスカッション
研究は大幅に進歩しましたが、がんとの闘いは科学界にとって依然として主要な課題の 1 つです。 現在のがん治療には、副作用、選択性の低さ、薬剤耐性など、いくつかの問題があることがわかっています。 これらの限界を克服するために、がん細胞に対するより効果的かつ選択的な作用を確立することを目的とした革新的なツールを開発するために、ナノテクノロジーがこの分野で出現している[40 ] 。 さまざまなナノ材料とナノ粒子が研究されてきました [ 41、42、43 過去数年間で、腫瘍学における 可能性について、 の 使用 ]。 ナノテクノロジーは、ドラッグデリバリー、イメージング、診断、治療などのいくつかのアプローチでがんと闘う機会を提供します。 例えば、ナノ粒子は、既存の抗がん化合物の薬物動態学的および薬力学的プロファイルを改善したり、がん治療を組み合わせたりするのに有用である可能性がある ] 44、45 [ 。 これに関連して、いくつかの金属ナノ粒子がヒトのがん細胞に対して非常に興味深い抗腫瘍活性を示しています。 46 ]。 その中でも、AgNP は、その独特の物理化学的特徴により、固有の抗増殖活性を示しています [ 47 ]。 AgNP は、がんの新世代の診断および治療ツールを開発するために研究されました [ 48 ]。 「グリーン」合成アプローチを通じて、簡単かつ安価な方法で安定した AgNP を生成することが可能です。
形状、サイズ、コーティングなどの AgNP の物理化学的特性は、生物学的挙動に影響を与えます [ 49 ]。 サイズが 100 nm 未満のナノ粒子は、より高い細胞毒性能力と、単核食作用系から逃れる高い能力を示します。 生物学的活性を評価するために、3 つの異なるタイプの ヨモギ – AgNP を生成しました。 pH 7 で合成されたヨモギ – AgNP はより高い活性を示し、がん細胞株におけるアポトーシス誘導を伴う強力な細胞増殖阻害と G1 細胞周期停止を示しました。 ヨモギ属植物を使用して合成された AgNP の抗増殖効果が調査され、用量反応様式で癌細胞に対する細胞傷害活性が見出されました [ ] 他の最近の研究では、 50、51 。 私たちの結果に従って、Fard et al。 によって媒介されるアポトーシス作用が、 ヨモギを使用して合成されたAgNP Bax や Bcl2 などのアポトーシス遺伝子の発現を増加させることを発見しました [ 52 ]。
の効果を深く調査するために ヨモギ – AgNP 、RNA 配列を実行しました。 トランスクリプトーム分析により、 ヨモギ – AgNP 処理後にいくつかの遺伝子が上方制御および下方制御されていることが示されました。 主要な DEG は細胞小器官の部分とその膜に関連しており、代謝プロセスと生物学的調節に関連していました。 AgNP は、さまざまな細胞プロセスを通じて細胞毒性を誘導します。 AgNP の取り込みは細胞毒性に影響を与え、AgNP のサイトゾル、ミトコンドリア、核への侵入を引き起こします。 AgNP は細胞内に入ると、ミトコンドリアの損傷、ATP 含有量の減少、活性酸素種 (ROS) 産生の増加、DNA の損傷など、いくつかのメカニズムを通じて細胞死を引き起こす可能性があります [53 ] 。 -Erk1/2、およびカスパーゼシグナル伝達を活性化することによって細胞のアポトーシスを誘導できます AgNP は、p53、 p [ 54 ]。 さらに、AgNP は、乳房、肝臓、腎臓、および単球系統に由来する非腫瘍形成性細胞と比較して、乳がんサブタイプの細胞に対してより選択的な細胞毒性効果を明らかにしました。 55 ].
この研究では、機能アッセイと RNA-Seq を組み合わせて、 ヨモギ – AgNP が細胞アポトーシスを誘導し、細胞周期停止、遺伝子発現の制御、および DNA 損傷応答を通じて細胞増殖を阻害することを観察しました。 KEGG 分析により、 ヨモギ – AgNP 治療における DEG は主に感染症と癌に富んでいることが明らかになりました。 PPI 解析から得られたハブ遺伝子は、リボソームタンパク質とユビキチンファミリータンパク質をコードする遺伝子でした。 UBA52およびRPS27A遺伝子は、それぞれリボソームタンパク質60Sリボソームタンパク質L40およびユビキチン-40Sリボソームタンパク質S27Aと融合したユビキチンの単一コピーをコードする[56 ] 。 実際、L40 および S27A は、ユビキチン C 末端伸長タンパク質として合成されるリボソームタンパク質です [ 57 ]。 L40 は遺伝子発現とストレス応答の制御に関与しています。 一方、27A はリボソーム生合成とタンパク質の翻訳後修飾、およびリボソーム外機能に役割を果たします。 UBA52 遺伝子と RPS27A 遺伝子は、肝癌細胞のアポトーシス中に異なる形で過剰発現されることが判明しました。 58 ]。 さらに、いくつかの研究では、RPS27A が細胞の悪性形質転換および化学療法耐性の増強と相関していることが判明しました ] 59、60 [ 。 さらに、ハブ遺伝子には、DNA 修復エンドヌクレアーゼに関与するリボソームタンパク質である RPS3 が含まれます。 このタンパク質は細胞のアポトーシス制御に役割を果たします。 RPS3 はアポトーシスを誘導し、そのシグナルはカスパーゼ 8 の活性化とそれに続くカスパーゼ 3 の活性化を通じて実行されます [ 61 ]。 RPL7 は細胞のアポトーシス制御にも関与しています。 さらに、RPLP0 は腫瘍形成、細胞形質転換、浸潤、転移に関与していることが判明しました。 RPLP0 は、P1 および P2 と相互作用して、P1 および P2 の二量体と P0 単量体からなる五量体複合体を形成できるリボソームタンパク質をコードします。 腫瘍、乳がん、胃がんにおけるRPLP0の過剰発現が示されている[ 62、63 腫瘍組織、特に婦人科 さまざまな研究により、 ]。 具体的には、RNA-seq によって分析されたダウンレギュレートされた遺伝子のいくつかは、細胞の増殖、遊走、腫瘍の進行において重要な役割を果たしています。 最近の研究では、RPS27A の下方制御が細胞増殖を阻害し、Caco-2 細胞のアポトーシスを誘導することが示されました。 64 ]。 さらに、別の研究では、RPS3 のノックダウンが Caco-2 細胞の増殖、生存、遊走、浸潤を阻害し、アポトーシスを増加させることが示されています。 この発見は、RPS3 ノックダウン細胞株における p53 タンパク質レベルの減少と相関しています。 興味深いことに、Caco-2細胞におけるp53のノックダウンはRPS3レベルに影響を与えず、これはp53がRPS3の下流標的である可能性を示している[ 65 ]。 最近の研究では、RPLP0 の下方制御により、HtTA 子宮頸がん細胞の細胞生存率と細胞増殖が低下し、細胞死が増加することが強調されています。 特に、RPLP0 レベルの下方制御は、細胞周期関連タンパク質および抗アポトーシスタンパク質であるサイクリン D1、サイクリン E1、Cdk4、および BCL-2 の発現レベルの低下と、プロアポトーシス BAX の発現レベルの増加と相関しています [ 66 ] 。 最後に、PPI 解析により、主要なハブ遺伝子が、細胞周期制御、アポトーシス制御、転写と翻訳の制御機構、DNA 修復など、がんの発生と相関する複数の細胞プロセスの制御に関与する遺伝子であることが特定されました。
の潜在的な抗増殖活性および抗がん活性を実証しました 最後に、ヨモギ – AgNP 。 の生体有機活性物質 ヨモギ と Ag+ イオンは、相乗的に作用して AgNP の抗がん特性を強化する可能性があります。 これらの成果は、分子機構に関する新たな洞察を提供し、革新的なナノスケールプラットフォームの開発を目的とした将来の研究への扉を開き、これは私たちが待望されているナノ医療の医療革命を達成するのに役立ちます。
4. 材料と方法
4.1. Artemisa-AgNP の合成と特性評価
Artemisia arborescens は 、10 g の新鮮な葉を溶媒混合物中で 50 °C で 30 分間穏やかに撹拌しながら加熱することにより、水アルコール溶液 (50:50) で抽出されました。 硝酸銀 (AgNO 3 次に、100 mL の植物抽出物を使用して、30 °C で 900 mL のミリク水中の 、340 mg、2 mmol) を還元しました。 ヨモギ – AgNP は 3 つの異なる pH 値 (7、8、9) で合成する必要があったため、NH 4 OH 濃縮溶液を数滴加えて、それに応じて pH を変更しました。 混合物の色は薄緑色から茶色に変化し、AgNP の形成を示しました。 色の濃さはpHによって変化しました。 24 時間後、反応が完了し、超遠心分離 (13,000 rpm) によって AgNP を回収し、空気下で乾燥させて特性を分析しました。
紫外可視スペクトルは、周波数範囲 600 ～ 350 nm でセル長 1 cm の石英キュベット内の T80+ 紫外可視分光光度計 (PG Instruments Ltd.、レスター、英国) で記録されました。 溶液の濃度は１ｍｇ／ｍＬであった。
FTIR スペクトルは、周波数範囲 4000 ～ 400 cm で FTIR VERTEX 70 分光光度計 (米国マサチューセッツ州ブルカー) で記録されました。 −1 解像度4cm −1 KBr ペレット (1:100 AgNP) で。
ナノ粒子の平均サイズ分布の決定は、分光散乱装置 Zeta Sizer Nano-S90 (Malvern Panalytical、Malvern、UK) を使用して実行されました。 サンプルを調製するために、乾燥した AgNPs 粉末 (1 mg) を 10 mL の蒸留水に分散させました。
のサイズと形態を研究しました 透過型電子顕微鏡分析 (TEM) を使用して、ヨモギ – AgNP 。 画像は、FEI TECNAI G2 F20 TWIN と 200 Kv の加速電圧を組み合わせて使用して取得されました。 AgNP の元素構造を調べるために、エネルギー分散型 X 線分光法を実行しました。 AgNP サンプルをエタノールに分散し、30 分間超音波処理しました。 ナノ粒子懸濁液を 1 滴、穴のあいたカーボン/銅グリッド上に置き、測定しました。
4.2. 細胞培養
HeLa (子宮頸部腺癌)、MCF-7 (乳癌)、および PC3 (前立腺癌) は ATCC から購入しました。 7 ～ 10 でした [ 67、68 細胞の 継代数は ]。 細胞は、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液および１０％ウシ胎児溶液（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。 すべての細胞株は、 5% CO 2中で 37 °C で増殖させました。 加湿インキュベーター中、
4.3. 増殖アッセイ (XTT)
XTT アッセイ (Cell Proliferation Kit II、スイス、バーゼルの Roche) を使用して細胞生存率を評価しました。 細胞は、異なるサイズ、表現型、および細胞集団倍加に応じて、1500～2000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種されました。 播種から 24 時間後、細胞を 3 つの異なる ヨモギ – AgNP の濃度を増加させて (0.5 ～ 20 μg/mL) 処理しました。 未処理の細胞を対照として使用した。 24 時間および 48 時間の治療後に XTT アッセイを実施しました。 電子カップリング試薬の存在下で、テトラゾリウム XTT 塩はホルマザンに変換されました。 最終容量として 100 μL/ウェルを考慮して、混合物を次のように調製しました: XTT 電子結合試薬 0.5 μL、標識試薬 25 μL、および培地 74.5 μL。 この混合物を使用して細胞を 37 °C で 4 時間インキュベートしました。 インキュベーション後、分光光度プレートリーダーを使用して490 nmで吸光度を測定しました。 すべての実験は 3 回繰り返して実行されました。
4.4. 細胞周期解析
細胞周期への影響を評価するために、HeLa と MCF-7 を 6 ウェル プレートに播種しました (5 × 105 細胞/ウェル)。 s pH 7で処理する 播種から 24 時間後、細胞を 7 μg/mL のArtemisia-AgNP か、未処理のまま放置しました。 細胞を6時間および18時間インキュベートし、その後、500gで5分間遠心分離する前に、上清および付着細胞を収集し た 。 したがって、ペレットをＰＢＳで洗浄し、前と同じ条件で再度遠心分離した。 細胞を固定するために、ペレットを 200 μL の PBS に再懸濁し、次に 70% の氷冷エタノールを使用してボルテックスで撹拌しました。 サンプルは -20 °C で最大 7 日間保管されました。 分析前に、固定細胞をPBSで2回洗浄し、200μLのPBSに再懸濁し、暗条件下で20μLの7aad標識とともに20分間インキュベートした。 細胞周期は、FACS CANTO II (BD Biosciences、ミラノ、イタリア) を使用して 20,000 件のイベントを収集することによって評価されました。 データは、DIVA ソフトウェア (BD Biosciences、ミラノ、イタリア) を使用して分析されました。
4.5. 壊死とアポトーシスの評価
AnnexinV/7aad 標識を使用して、生細胞、アポトーシス細胞、および壊死細胞を識別しました。 と 24 時間インキュベートした後 7 μg/mL のヨモギ – AgNP 、上清と付着細胞を収集しました。 遠心分離後、ペレットを50μLのアネキシンV 1×緩衝液に再懸濁し、アネキシンV/7aadで染色した。 暗所で20分間インキュベートした後、200μLのアネキシンV 1×緩衝液を各サンプルに添加し、フローサイトメトリー(FACS CANTO II BD Biosciences、ミラノイタリア)によって細胞蛍光を測定し、20,000イベントを収集した。 DIVAソフトウェアを使用してデータを分析しました。
4.6. コロニーアッセイ
HeLa 細胞を 6 ウェル プレートに 100 ～ 200 細胞/ウェルの濃度で播種しました。 細胞は最も初期のコロニーの形成後、通常は播種から 5 ～ 7 日後に処理されました。 細胞を37℃でインキュベートし、対照サンプルが目に見える十分なコロニーを形成するまで、3日ごとにAgNPの有無にかかわらず培地を交換しながら約2週間培養を維持しました。 細胞コロニーを視覚化するために、細胞を 2 mL の 6.0% グルタルアルデヒドおよび 0.5% クリスタルバイオレットで 30 分間染色しました。 ddH2O で洗浄した後、染色されたコロニーを数え、処理サンプルを対照と比較しました。
4.7. mRNAの抽出とmRNA-Seqライブラリーの調製
HeLa 細胞を 2 × 105 の密度で 6 ウェルプレートに播種しました。7 μg/mL の ヨモギ – AgNP で 6 時間および 18 時間処理した後、500 g での遠心分離によって細胞を収集し、ペレットを 2 回洗浄しました。 PBSで。 メーカーのプロトコールに従って、RNeasy MINI Kit (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用して全 RNA を抽出し、RNA の品質を Agilent 2100 Bioanalyzer で評価しました。 RNaseH 消化とリボソーム除去 RNA を使用して、トータル RNA から rRNA を除去し、VAHTSTM RNA Clean Beads で精製しました。
ランダムプライマーを使用して cDNA を合成し、2 番目の鎖を標識するために dUTP を組み込みました。 磁気ビーズを使用してフラグメントを精製し、150 ～ 200 bp のフラグメントを得ました。 ライブラリーは Hiseq-PE150 で配列決定されました。
4.8. 品質管理と遺伝子解析
まず、得られた生の配列データの品質を fastQC で確認しました。 Trimmomatic ソフトウェアを使用して低品質の未測定の塩基をフィルタリングし、最終的なクリーンなデータを取得しました。 ゲノムおよび遺伝子注釈ファイルの参照を提供するために、hg38 参照ゲノム (grch38.p12. genome) および遺伝子注釈 GTF (GRCh38、バージョン 30、Ensembl 96) をジェンコード データベースにダウンロードしました。 RSEM ソフトウェアを使用して、RNA-Seq データから転写物の存在量を定量しました。 参照ゲノムおよび遺伝子注釈ファイルは、デジタル遺伝子発現解析に使用されました。 その後、RSEM によるクリーンリードの発現レベル分析を取得し、サンプルからの遺伝子発現結果を得るために STAR アライメントを使用しました。 各遺伝子配列にマッピングされた読み取りセグメントの数は、遺伝子の長さと配列決定の深さを考慮して、FPKM (100 万読み取りあたりのキロベースあたりのフラグメント) によって計算されました。 FPKM は、遺伝子の発現値を推定できる正規化推定量です。 DEseq を実行して、対照群と処理サンプル間の遺伝子発現の違いを分析しました。 示差的遺伝子スクリーニング基準は、パラメーター値 log2 倍率変化と p 値 (|logFC| ≥ 2 および p 値 < 0.05)。
4.9. GO エンリッチメントと KEGG パスウェイ分析
生物学的プロセスと分子機構を解明するには、差次的発現遺伝子 (DEG) の機能および経路濃縮分析が必要であったため、GO 濃縮および KEGG 経路分析を、関与する主要な遺伝子および経路の同定に適用しました。 GO は Gene Ontology Database の略で、遺伝子機能について標準化された国際分類システムです。 遺伝子の分類はオントロジー (またはグラフ構造) に編成され、分子機能、細胞成分、生物学的プロセスの 3 つのカテゴリにグループ化されます。 遺伝子オントロジー データベースは通常、遺伝子産物の注釈付けと配列決定に使用されます。 したがって、GO 機能分析は、DEG の GO 機能分類と GO 機能的重要性の強化を提供する可能性を提供します。 使用して、DEG の主要な生物学的機能が決定されました [ ] 69、70 GO 有意濃縮分析を 。
KEGG（京都遺伝子・ゲノム百科事典）は、ゲノム情報と遺伝子機能を体系的に解析するためのデータベースです。 KEGG データベースを使用すると、遺伝子産物の代謝経路と機能の分析が可能になり、遺伝子と遺伝子発現ネットワークの調査が容易になります。 KEGG には、ゲノム、化学分子、代謝経路、薬物、疾患、遺伝子配列などの生化学システムからのデータが組み込まれています。 経路の重要性の濃縮を評価するために KEGG 分析が実行され、全ゲノム バックグラウンドと比較して経路の DEG が有意に濃縮されていることを調べるために超幾何検定が使用されました [71 ] 。
4.10. 主要モジュールとハブ遺伝子の特定
STRING (STRING。オンラインで入手可能: http://string-db.org 2019 年 6 月 17 日) を使用して、遺伝子ネットワーク解析を実行することによりハブ遺伝子を評価しました。 STRING には、直接的な物理的相互作用や間接的な機能的関係を含む、タンパク質間の相互作用を予測および検証できるデータベースが含まれています。 これは、コンテンツ管理文献からの実験データとバイオインフォマティクス手法を使用した結果の予測に基づいています。 解析に使用される生物学的手法には、染色体の近接性、遺伝子融合、系統樹、遺伝子チップデータの遺伝子共発現などが含まれます。 スコアリング メカニズムは、さまざまな方法で得られた結果を設定するためにシステムによって使用されます。 STRING を使用すると、発現差解析の結果とデータベースと DEG 間の相互作用を組み合わせた相互作用ネットワークを構築できます。
4.11。 統計分析
データは反復の平均値 ± SD として表示されます。 すべての実験は少なくとも 3 回実行されました。 データはスチューデントの t 検定を使用して分析され、差は p < 0.05 で有意であるとみなされました。 フローサイトメトリーのデータ分析は、FACSDiva ソフトウェア (BD-Bioscience Mountain View、CA、USA) を使用して実行されました。
著者の寄稿
LB と SM はこのプロジェクトのアイデアを考案し、実験を監督しました。 VB と LS は生物学的実験を設計、実行し、データを分析しました。 SZ は結果の統計分析と論文の改訂に貢献しました。 WL と DJK は、RNA 配列解析と結果の解釈に貢献しました。 SM は ヨモギ – AgNP EA の助けを借りてこの研究で使用された を合成および特性評価し、VB はすべての著者からの貢献と支援を得て原稿を執筆しました。 すべての著者は原稿の出版版を読み、同意しました。
資金調達
この研究には外部からの資金提供はありませんでした。
治験審査委員会の声明
適用できない。
インフォームド・コンセントの声明
適用できない。
謝辞
ボルドーニ V は博士号によって財政的に支援されています。 サッサリ大学の生命科学およびバイオテクノロジー学部 (PORFSE 2014–2020)。
利益相反
著者は利益相反がないことを宣言します。
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